大鼠心肌微血管内皮细胞的体外培养

·论著·

大鼠心肌微血管内皮细胞的体外培养

唐标　曹苏　康焕菊　朱翔　陈秋萍　盛俞

【摘要】　目的　探讨大鼠心肌微血管内皮细胞离体培养方法。方法　选取1～2周龄的SD 大鼠,无菌条件下快速取出心脏,彻底去除大血管、心房、右心室和心内外膜。用植块法培养心肌微血管内皮细胞。倒置显微镜下形态学观察结合免疫细胞化学方法检测第Ⅷ因子相关抗原和CD34对培养细胞进行鉴定。结果　细胞呈单层贴壁生长,融合后呈“铺路石样”;第Ⅷ因子相关抗原和CD34免疫细胞化学鉴定阳性。结论　成功培养出纯度较高的大鼠心肌微血管内皮细胞,方法简便,可用于心血管疾病的研究。

【关键词】 微血管内皮细胞;心肌

【中图分类号】　R541 【文献标识码】　A 【文章编号】　0253-3685(2010)08-0941-02

C ulture of rat m yocardial microvascular endothelial cells in vitro T ANG Biao ,CAO Su ,K ANG Huanju ,et al .Depatment of Anesthesiology ,Affiliated Hospital ,Nantong University ,Nantong 226001,CHI NA

【Abstract 】　Objective T o establish a method of culturing rat my ocar dial micro vascular e ndothelial cells (M M VECs )in ve tro .Methods SD ra ts (1-2w eeks o f ag e )were selected .T he heart was rapidly excised and the g reat vessels ,atria ,rig ht ventricle ,epicardium and endocardium w ere remov ed .Explants cultiv ation of ca rdiac tissues w as used to obtain the primar y ce lls .T he purified ce lls were identified as v ascula r endothelial cells by mo rphology a nd positive immuno cy tochemistry fo r facto r Ⅷ-rela ted antig en and CD34.Results T he cells w ere adher ent ,prolifer ated in a mo no laye r .Co bble sto ne like cells we re obser ved under micr oscope after coa lesced .T he cells sho wed po sitive staining fo r facto r Ⅷ-related antigen and CD34.Conclution M M V ECs with hig h purity a re o btained .T he me tho d is sim ple a nd co nvenient ,and can be used to study the cardiov ascula r disea se .

【Key words 】 M icrov ascula r endothelial cells ;M y ocar dium

[Jiangsu Med J ,April 2010,36(8):941-942.]

作者单位:226001　南通大学附属医院麻醉科责任作者:曹苏　E -mail :mzk cs @sina .com 心肌缺血性损伤是临床常见的病理现象,心肌

微血管内皮细胞(M M VEC s )的功能和病理改变直

接影响心肌细胞的功能。MM VECs 与大血管内皮

细胞之间及各脏器微血管内皮细胞之间表现出不同

的功能异质性。M M VEC s 是心肌缺血损伤的起始

部位[1,2],对心肌缺血及再灌注损伤等研究有重要

价值。

材料与方法

一、实验材料

CO 2培养箱(ESPEC ,日本);超净台(苏州净化

设备有限公司);高糖DM EM 和0.25%胰蛋白酶

(Gibco ,美国);胎牛血清(杭州四季青生物工程材料

有限公司);内皮细胞生长添加剂、兔抗鼠Ⅷ因子相

关抗原多克隆抗体和兔抗鼠CD34多克隆抗体(北

京迈晨科技有限公司);即用型免疫组化试剂盒和浓缩型DAB 试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)。二、实验方法1.取材　选取1～2周SD 大鼠(南通大学实验动物中心提供),用碘伏浸泡消毒,无菌条件下开胸,快速取出心脏。在高糖DM EM 基础培养基中洗净血液,用眼科剪剪去大血管、心房和右心室,剪开左心室。用75%乙醇浸泡10s 以灭活心内膜和心外膜细胞,在基础培养基中洗净乙醇。在解剖显微镜下,用显微镊和显微剪刀完整剥去心外膜,剪去心内膜。余下的心肌用基础培养基洗两遍。2.原代培养和传代　把心肌剪碎成约1～2mm 3

组织块,将组织块快速接种于事先用含胎牛血清培养基润湿过的一次性培养皿中。组织块间距约2～3m m 。置于37℃,5%CO 2培养箱中孵育2h 。等组织块贴牢后加入高糖DMEM 完全培养基(含

20%的胎牛血清、50m g/L肝素、15mg/L内皮细胞生长添加剂、100U/L青霉素、100m g/L链霉素)。置于CO2培养箱37℃培养65h,去除组织块,更换培养基,继续培养3～4d。等细胞生长接近融合时传代培养,倒弃原培养基,用基础培养基洗涤两遍。加入0.15%胰蛋白酶1m l,常温下消化约3min,镜下见细胞收缩、细胞间隙增宽,接着细胞变圆变亮成簇时倾去消化液,加入完全培养基。用滴管轻轻吹打,制成细胞悬液。余未脱落细胞可能为成纤维细胞,弃去。将细胞悬液按1∶2接种于新的培养皿。因血管内皮细胞传代后易失去组织特异性,我们将二代以内的细胞用于实验。

3.免疫细胞化学鉴定　将细胞悬液接种至放有盖玻片(已用多聚赖氨酸包被)的24孔培养板内。细胞生长至约80%融合时倒去培养基,用0.01 M PBS洗涤两遍。室温下,用4%多聚甲醛固定5min,0.3%T rito nX-100破膜5min。37℃下10%正常山羊血清封闭30min,用ABC法检测Ⅷ因子相关抗原和CD34的表达。兔抗鼠Ⅷ因子相关抗原抗体和CD34多克隆抗体浓度均为1∶50,4℃孵育过夜。室温下,二抗孵育2h。用DAB(1∶50)显色。

结果

一、M MV EC s的生长与形态

组织块在37℃CO2培养箱中孵育24h,可见组织块边缘有少量梭形细胞长出。原代培养大鼠心肌微血管内皮细胞铺满时呈“铺路石样”(见封三页图1)。

二、免疫细胞化学染色

用免疫细胞化学ABC法检测Ⅷ因子相关抗原和CD34,胞浆中有棕黄色着色,即呈阳性反应(见封三页图2、图3)。95%细胞以上呈阳性。

讨论

培养心肌微血管内皮细胞(MM VECs)较为困难。我们根据张涛等,Nishida等[3,4]的方法,结合本实验室的条件,成功地实现了这种M MVECs的分离培养。

我们的方法具有以下优点:(1)用基础培养基替代PBS和hanks液等洗涤心脏和组织块,能提供更充足的养分,最大程度地保护心肌组织,利于细胞长出,提高成功率。(2)75%乙醇灭活结合心内外膜剥除。剪开左心室后先用75%乙醇浸泡10秒,使心内外膜充分地与乙醇接触,达到灭活心内外膜细胞的目的。然后在解剖显微镜下用镊子完整剥下心外膜,用显微剪刀充分剪除心内膜。最大程度地避免成纤维细胞等的污染。解决了细胞纯度的关键问题。(3)接种组织块的培养皿先用含血清培养基润湿底壁,在干枯培养阶段,能充分供应各种养分,减少组织损伤,使组织块贴壁更牢固。

在植块65小时时即把组织块去除,避免随后的成纤维细胞及其它细胞的爬出。在传代时用差速消化法进一步去除成纤维细胞[3]。我们选用出生1～2周的SD大鼠,组织细胞分裂增殖能力较强。

大量研究证明MM VECs在心脏生理与病理过程(如缺血、心肌肥大等)中发挥着非常重要的作用。血管内皮细胞通过合成与释放多种生物活性物质调节血管张力、血细胞黏附性,影响组织的代谢[5]。在心肌缺血性损伤中,MM VECs是受累的起始部位和心肌损伤的起因。内皮细胞功能紊乱,白细胞黏附、渗出、浸润至心肌组织是心肌缺血-再灌注损伤的重要病理机制。熟练、成功地体外分离和培养M M VECs对于研究心脏的病理生理具有重要价值。

参考文献

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[2]　娄晋宁.微血管内皮细胞培养及其在医学研究中的应用[J].微

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[3]　张涛,滕可导,田启超,等.乳鼠心肌膜微血管内皮细胞的体外

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[4]　Nis hida M,Crakey WW,Gerrotsen M E,et al.Isolation and

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(收稿日期:2010-01-05)(供稿编辑:王建华)