丙酮丁醇梭菌发酵产氢工艺研究

由 Statistica 或 SPSS 对实验数据进行多项式 回归拟合可分别得到氢气 、丙酮和正丁醇的 2 次经 验模型 :
Y氢气 = 0. 506 x1 2 + 0 . 011 x2 2 - 1. 07 x3 2 0. 156 x1 x2 + 0. 09 x1 x3 + 0. 205 x2 x3 + 0. 27 x1 0. 175 x2 - 7. 663 x3 + 6. 638
X1
X2
X3
E. V
P. V.
E. V
P. V.
E. V P. V.
1
1
1
1
10. 49
10. 0
2
1
1
21
4. 61
5. 01
3
1
21
1
9. 82
9. 76
4
1
21
21
6. 01
5. 54
5
21
1
1
9. 89
9. 80
6
21
1
21
9. 63
9. 32
7
21
21
1
6. 82
5. 87
8
21
21
21
6. 50
Note : X1 , X2 and X3are temperat ure ,p H and hot t reating time re2 spectively.
Fig 1 Time co urse of anaero bic fermentation by Clost ri di2 um acetobut y licum
林赛珍等 :丙酮丁醇梭菌发酵产氢工艺研究
137
(30 m ×0. 32 m ×1. 0μm) ;检测器 : FID (280 ℃) ; 载气压力 :氮气 (0. 6 M Pa) ;空气压力 :0. 03 M Pa ; 氢气压 力 : 0. 1 M Pa ; 柱 温 : 85 ℃; 内 标 物 : 乙 酸 乙酯 。 1. 4 实验设计方法
Y丙酮 = - 0. 890 x1 2 - 0. 047 x2 2 - 0. 416 x3 2 + 0. 97 x1 x2 + 0. 222 x1 3 + 0. 141 x2 x3 + 6. 330 x1 + 3. 793 x3 - 99. 180
Y丁醇 = - 0. 164 x1 2 - 0. 065 x2 2 - 2. 616 x3 2 1. 090 x1 x2 + 0. 925 x1 x3 + 0. 549 x2 x3 + 74. 618 x1 + 11. 679 x2 - 19. 547 x3 - 430. 034
Tab 1 The variables and level of cent ral compo site designs
Variable
X1 / ℃ X2
X3 / min
21. 682
35. 32 4. 66 0. 16
Coded level 21 0 1 1. 682 △Xi
36 37 38 38. 68 1 5 5. 5 6 6. 31 0. 5 0. 5 1 1. 5 1. 84 0. 5
1. Acetone ; 2. Dichloromet hane ; 3. Et hyl acetate ; 4. n2butanol Fig 2 Gas chromotograp hy of aceto ne and , n2butanol
2. 3 中心组合实验设计 (CCD) 优化结果 2. 3. 1 模型的建立[8] 选择温度 、p H 值和热休 克时间为自变量 ,选择中心点实验数为 6 ,星号臂 长γ = 1. 682 。各自变量水平见表 1 ,实验设计及 结果见表 2 。
摘 要 采用响应面法对丙酮丁醇梭菌的发酵条件进行了优化 ,确定了厌氧发酵最佳条件为温度 38 ℃、p H 值 6. 0 、热休克时间 1. 5 min 。在此条件下进行实验 ,所得氢气含量高达 10. 5 L/ L ,丙酮含量为 5. 94 g/ L ,正丁醇 含量为 9. 41 g/ L 。
关键词 生物制氢 ;发酵 ;丙酮丁醇梭菌 ; GC ;响应面法 中图分类号 :Q81 文献标识码 :A 文章编号 :100528915 (2006) 0220136205
10. 1 8. 46 10. 3 9. 61 7. 78 7. 24 5. 82 6. 20 7. 08 A. V. 5. 36 A. V. 4. 86 6. 77 7. 95 7. 95 7. 95 7. 95 7. 95 7. 95
6. 38
9
21. 682
0
0
5. 64
7. 07
10
+ 1. 682
0
0
5. 56
6. 56
11
0
21. 682
0
11. 53
12. 3
12
0
+ 1. 682
0
5. 74
5. 54
13
0
0
21. 682
6. 67
A. V.
14
0
0
+ 1. 682
10. 0
10. 8
15
0
0
0
10. 47
9. 76
图中可见丙酮丁醇梭菌的代谢可分为 3 个时 期 ,即前发酵期 、主发酵期和后发酵期 。在前发酵 期 (0～24 h) ,菌体基本上不产氢气也不产丙酮 ;在 主发酵期 (24～55 h) ,菌体处于对数生长期 ,氢气 和丙 酮 的 产 量 迅 速 增 加 ; 在 后 发 酵 期 时 ( 55 ～ 72 h) ,丙酮和氢气的产量不再明显增加 。根据这 一特点 ,确定丙酮丁醇梭菌的发酵时间大约为 3 d 。
3 收稿日期 :2005208216 修回日期 :2005212222 作者简介 :林赛珍 ,浙大硕士 ,联系地址 :浙江大学玉泉校区 12 舍 314 ,邮编 :310027 ,电话 :13958134074 ,0571287931686
3 通讯作者 :金志华 ,教授 ,宁波市人 ,联系地址 :浙大宁波理工学院生化分院 ,邮编 :315100 ,电话 :0574288229075
用 Statistica 软件对实验数据进行分析和拟 合 。所拟合方程 (式 1) 分别对各自变量求偏导数 便可找到产生氢气 、丙酮和正丁醇的最适宜条件 。
2 结 果
2. 1 培养时间的确定 在种子培养过程中 ,每隔 8 h 取样测定丙酮含
量 ,p H 值和氢气的产量 ,所得丙酮丁醇梭菌的生 长曲线如图 1 所示 。
1 材料与方法
1. 1 菌株 菌种 :丙酮丁醇梭菌 ( Clost ri di um acetobut y l2
icum CICC 8008) ,购自中国工业微生物菌种保藏 中心 。 1. 2 培养基及培养方法 1. 2. 1 培养基 以 4 %～ 6 %玉米粉为基础培 养基 。 1. 2. 2 培养方法 菌种先在沸水浴下热处理[5] 1～2 min ,再于 35 ℃～39 ℃下厌氧培养 。 1. 3 分析方法 1. 3. 1 氢气的测定 利用氢气的易燃性且燃烧后 生成水的特性进行定性测定 ,并用排水集气法收集 气体和定量测定 。 1. 3. 2 菌浊度的测定 用去离子水稀释发酵液至 适宜的浓度 ,用分光光度计测 OD600 值 。 1. 3. 3 还原糖测定方法 采用 DN S[6] 测还原糖 浓度 。 1. 3. 4 丙酮和正丁醇含量测定[7] 培养基中含有 大量的水 ,在用 GC 色谱分析前对发酵液进行预处 理 。预处理方法 :将发酵液在 4 000 r/ min 下离心 10 min ,取 10 ml 上清液 ,经 10 ml ,10 ml 的二氯甲 烷萃取 2 次 ,再准确地加入 0. 1μl 内标物 (乙酸乙 酯) 。气相色谱参数如下 ,色谱柱 :毛细管柱 SE 30
β23 x2 x3 +β11 x1 2 +β22 x2 2 +β33 x3 2 …(式 1) 式中 : Y 为氢气 (L/ L) 、丙酮或正丁醇含量 ( g/ L) 的 预测响应值 ;Xi (i = 1 ,2 ,3) 为自变量 ;βi β, ii β, ij (i ,j = 1 ,2 ,3) 均为交互系数 。
5. 93 5. 30 5. 39 4. 98 3. 75 3. 41 3. 41 3. 28 3. 53 A. V. 2. 62 3. 23 2. 81 3. 57 3. 53 3. 53 3. 53 3. 53 3. 53 3. 53
9. 41 8. 69 10. 4 9. 43 8. 29 7. 46 5. 92 7. 23 5. 67 6. 88 4. 9 6. 09 4. 35 7. 04 7. 92 8. 23 8. 09 8. 06 8. 1 8. 08
138
药物生物技术
第 13 卷第 2 期
Tab 2 Experimental result s of cent ral compo site designs
Facto r No .
H2 yield (L/ L)
Aceto ne co ncent ration (g/ L)
n2Butanol concent ratio n (g/ L)
ຫໍສະໝຸດ Baidu
能源短缺和环境污染是新世纪人类所面临的 重大挑战 。与其它传统的能源燃料相比 ,氢气具有 能量密度高 、热转化效率高 、输送成本低 ,燃烧时只 生成水 ,无二次污染物等诸多优点 。现有的制氢技 术包括物理化学方法和生物方法两大类 。物理化 学方法制氢技术成熟 、氢纯度高 ,但效率低 、能耗 高 、制氢成本昂贵 。生物制氢可有效利用生物能 源 ,且可减少工农业废弃物对环境的污染以及对石 化燃料的使用 。与物理化学方法相比 ,生物制氢具 有高效 、节能 、成本低等诸多优点而备受关注[1] 。 随着技术的发展 ,生物制氢的方法也不断地多样 化 。有资料报道 :采用活力强的产气夹膜的最大的 产氢速度为 18～23 L/ h ; 任南琪等采用有机废水 发酵法生物制氢技术获得产氢能力可达 5. 7 L H2 / L 发酵液[11 ] ;J o nat han Woo dward 用 10 种商 业用酶使戊糖磷酸盐循环与氢酶产氢过程相耦合 , 使产氢达到 11. 6 mol/ mol 葡萄糖[13] ;利用类腐败 梭状芽孢杆菌 M221 ( Clost ri di um p a ra p ut ri f icum M221) 进 行 发 酵 , 1 mol 的 葡 萄 糖 可 以 产 生 1. 05 mol的氢气[1 ] 。本文以丙酮丁醇梭菌[2 ] 为产 生菌 ,以玉米粉[3 ,4] 为基础培养基 ,在间歇反应器 中通过厌氧发酵生产氢气 ,对发酵产氢的条件进行 了优化 。
本文 采 用 中 心 组 合 实 验 设 计 方 法 ( Cent ral Co mpo site Designs) [8] ,用多项式回归分析对实验 数据进行拟合 ,该方程描述响应量 (氢气 、丙酮或正 丁醇含量) 和自变量 (培养条件) 关系之间的经验模 型[8] 。其二阶经验模型可描述为 : y = β0 +β1 x1 +β2 x2 +β3 x3 +β12 x1 x2 +β13 x1 x3 +
药 物 生 物 技 术
136
Pharmaceutical Biotechnology 2006 ,13 (2) :136～139
丙酮丁醇梭菌发酵产氢工艺研究 3
林赛珍1 ,2 ,徐 敏1 ,章宗铭1 ,周牡丹1 ,陈奇剑1 ,金志华1 ,2 3
(1. 浙江大学 宁波理工学院生物与化学工程分院 ,浙江 宁波 315100 ; 2. 浙江大学材化分院化学工程系 ,浙江 杭州 310027)
16
0
0
0
9. 89
9. 76
17
0
0
0
9. 78
9. 76
18
0
0
0
11. 16
9. 76
19
0
0
0
9. 58
9. 76
20
0
0
0
9. 5
9. 76
5. 94 5. 20 5. 40 5. 13 3. 59 3. 38 3. 48 3. 24 3. 15 3. 16 2. 51 3. 40 2. 81 3. 61 3. 44 3. 58 3. 52 3. 50 3. 52 3. 51
2. 2 气相色谱分析 2. 2. 1 定量计算 在上述色谱工作条件下 ,每样 品平行进样 5 次 ,取其平均响应值 。采用内标法[9] (乙酸乙酯为内标物) 对样品进行定量 。 2. 2. 2 气相分析 发酵液样品的 GC 图如图 2 所 示 ,丙酮 、二氯甲烷 、乙酸乙酯和正丁醇的保留时间 分别为 2. 067 、2. 173 、2. 543 和2. 903 min 。