基因工程育种技术

6.蛋白质和酶基因诱变的策略 6.蛋白质和酶基因诱变的策略
（1）引入二硫键提高蛋白酶的技术 （2）改变天冬酰胺提高稳定性技术 （3）提高酶活性 （4）改变酶的专一性 （5）其他基因改造技术 A、改变依赖钙离子的酶的特征 B、降低蛋白对蛋白酶的敏感性
7.基因敲除技术 7.基因敲除技术
利用生物体内的同源重组系统， 利用生物体内的同源重组系统，在一定选择压力下使体外改 造的带有选择标记或一定功能基因与受体细胞染色体上的功 能基因之间发生同源重组， 能基因之间发生同源重组，从而使受体细胞特定基因失活或 改变细胞的遗传特性. 改变细胞的遗传特性. 基因敲除的基本原理是通过一定的途径使机体特定的基因失 活或缺失的一种分子生物学技术。 活或缺失的一种分子生物学技术。 基因敲除可分为3 基因敲除可分为3类：同源重组、随机插入突变和RNAi基因敲 同源重组、随机插入突变和RNAi基因敲 RNAi 除技术。 除技术。
DNA家族改组 利用基因家族同源序列进行DNA改组， DNA改组 DNA家族改组。利用基因家族同源序列进行DNA改组，实现同源重
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组。由于同源序列是经过自然选择保留下来的相对有益或无害 的片段， 改组的突变机率和改组效率明显提高， 的片段，所以基因家族 改组的突变机率和改组效率明显提高， 体现了基因的多样性。 体现了基因的多样性。
3.定点诱变 3.定点诱变
定点诱变、位点专一的诱变、 定点诱变、位点专一的诱变、寡核苷酸定向诱变 基因定位突变是指将某一克隆基因按预先设计好的目标 进行定点改造。它仅适用于基因序列已清楚， 进行定点改造。它仅适用于基因序列已清楚，甚至蛋白 质三维结构已弄清， 质三维结构已弄清，蛋白结构与功能的关系比较清楚的 基因。定位突变的方法主要包括DNA聚合酶法和 聚合酶法和PCR 基因。定位突变的方法主要包括 聚合酶法和 其共同点是将突变点设计在DNA复制引物中，由 复制引物中， 法。其共同点是将突变点设计在 复制引物中 此获得的DNA链就含有预期的突变。 链就含有预期的突变。 此获得的 链就含有预期的突变
利用随机插入突变技术进行基因敲除 利用某些能随机插入基因序列的病毒、 利用某些能随机插入基因序列的病毒、细菌或其他基 因载体，在目标细胞基因组中进行随机插入突变， 因载体，在目标细胞基因组中进行随机插入突变，建 立一个携带随机插入突变的细胞库， 立一个携带随机插入突变的细胞库，然后通过相应的 标记进行筛选获得相应的基因敲除细胞 （2）利用转座子进行基因敲除 基于PCR PCR方法的基因敲除 （3）基于PCR方法的基因敲除 （4）噬菌体退火蛋白介导的寡核苷酸重组系统 RNAi引起的基因敲除 （5）RNAi引起的基因敲除
5.转座子诱变 5.转座子诱变
转座子诱变被称为生物诱变 转座子是DNA插入因子的一种， 转座子是DNA插入因子的一种，是指能在基因组间或 DNA插入因子的一种 组内跳跃的DNA片段.转座子诱变技术:(1)将转座子 组内跳跃的DNA片段.转座子诱变技术:(1)将转座子 DNA片段 :(1) 插入靶基因；(2)筛选感兴趣的突变体 筛选感兴趣的突变体， 插入靶基因；(2)筛选感兴趣的突变体，并证实该突 变是由转座子插入引起的；(3)确定并克隆靶基因 确定并克隆靶基因。 变是由转座子插入引起的；(3)确定并克隆靶基因。 （1）染色体基因诱变 （2）革兰氏阴性细菌的转座子诱变
（1）利用同源重组进行基因敲除 基因敲除是在同源重组技术及胚胎干细胞技术的基础 上逐步完善发展起来的，主要是利用DNA转化技术， 上逐步完善发展起来的，主要是利用DNA转化技术， DNA转化技术 将含有目的基因和靶基因同源片段的重组载体导入靶 细胞，通过载体与靶细胞染色体上同源序列间的重组， 细胞，通过载体与靶细胞染色体上同源序列间的重组， 将外源基因整合人内源基因组内， 将外源基因整合人内源基因组内，使外源基因得以表 达。通过研究靶细胞或者个体在目的基因插入前后遗 传特性的改变，达到研究基因功能的目的。 传特性的改变，达到研究基因功能的目的。
DNA改组 改组（ shuffling),又称有性PCR。DNA改组与易错PCR结合 又称有性PCR 改组与易错PCR结合； （2）DNA改组（DNA shuffling),又称有性PCR。DNA改组与易错PCR结合；
是指先通过DNaseI对目的基因切成随机片段，然后进行PCR 是指先通过DNaseI对目的基因切成随机片段，然后进行PCR DNaseI对目的基因切成随机片段 重聚，由于同源重组而产生基因突变的方法， 重聚，由于同源重组而产生基因突变的方法，点突变率可达 0.7%。
①内切酶片段的改组 DNase片段的改组 ②DNase片段的改组 ④基因组改组 定点诱变与DNA DNA改组结合 ③定点诱变与DNA改组结合
交错延伸法(staggered process（3）交错延伸法(staggered extension process-StEP
一种简化的DNA改组技术，它将含有不同点突变的模板混合， 一种简化的DNA改组技术，它将含有不同点突变的模板混合， DNA改组技术 随之进行多轮变性，短暂复性后随之延伸反应。在每个循环中， 随之进行多轮变性，短暂复性后随之延伸反应。在每个循环中， 同的模板配对， 延伸的片段在复性时与不 同的模板配对，最终合成的全长是包 含了不同模板DNA的信息。此种方法省去了酶切的过程， DNA的信息 含了不同模板DNA的信息。此种方法省去了酶切的过程，大大简 化了时间，提高了效率。 化了时间，提高了效率。
2.定向诱变（人工进化） 2.定向诱变（人工进化） 定向诱变
定向诱变、人工进化、 定向诱变、人工进化、定向进化
易错PCR （1）易错PCR
是一种简便快速的在DNA序列中随机制造突变的方 是一种简便快速的在DNA序列中随机制造突变的方 DNA 它是通过改变传统PCR反应体系中的Mg2+浓度、 PCR反应体系中的Mg2+浓度 法。它是通过改变传统PCR反应体系中的Mg2+浓度、 dNTP的浓度比例 pH值或使用低保真度的Taq酶 的浓度比例、 值或使用低保真度的Taq dNTP的浓度比例、pH值或使用低保真度的Taq酶， 使碱基在一定程度上随机引入错误而创造序列多 样性文库。 样性文库。
基因替代（等位基因）出现在染色体某特定座位上的两个或多个基因中的一个。 基因替代（等位基因）出现在染色体某特定座位上的两个或多个基因中的一个。 同源重组（两侧同源序列）基因的同源重组，又称基因打靶，指外源DNA与受体 同源重组（两侧同源序列）基因的同源重组，又称基因打靶，指外源DNA与受体 DNA 细胞染色体DNA上的同源序列之间发生重组，并整合在预定位点上，从而改变 细胞染色体DNA上的同源序列之间发生重组，并整合在预定位点上， DNA上的同源序列之间发生重组 细胞遗传特性的方法。同源重组发生在两个同源DNA分子之间， DNA分子之间 细胞遗传特性的方法。同源重组发生在两个同源DNA分子之间，真核细胞减数 分裂过程中，同源染色体彼此配对，同源染色体DNA片段发生交叉与互换。 DNA片段发生交叉与互换 分裂过程中，同源染色体彼此配对，同源染色体DNA片段发生交叉与互换。 （1）基于抗药性标记和自杀质粒的取代方法 有宿主范围广的特点，具有接合转移基因。它的复制需要一种特殊的蛋白， 有宿主范围广的特点，具有接合转移基因。它的复制需要一种特殊的蛋白， 大多数细菌不产生这种蛋白质，因此，当进入寄主细胞时，要么不能复制， 大多数细菌不产生这种蛋白质，因此，当进入寄主细胞时，要么不能复制， 被消除，要么被整合入染色体上，和染色体一起复制。 被消除，要么被整合入染色体上，和染色体一起复制。利用自杀质粒的这个 特点，将基因工程技术构建的基因缺失的DNA片断，克隆入自杀质粒， DNA片断 特点，将基因工程技术构建的基因缺失的DNA片断，克隆入自杀质粒，利用缺 失基因两端的同源片断，定位自杀质粒的整合位点。利用同源性DNA DNA片断可发 失基因两端的同源片断，定位自杀质粒的整合位点。利用同源性DNA片断可发 生重组的原理，构建精确基因缺失菌株。在多数情况下，利用自杀质粒， 生重组的原理，构建精确基因缺失菌株。在多数情况下，利用自杀质粒，可 随心所欲缺失大多数基因的任何部分。 随心所欲缺失大多数基因的任何部分。 （2）基于温度敏感复制子介导的取代
借助噬菌体M13 M13的定点诱变 （1）借助噬菌体M13的定点诱变 （2）借助质粒的诱变
4.PCR诱变 诱变 4.
（1）PCR定向诱变 PCR定向诱变 几种碱基变化的PCR PCR引入 （2）几种碱基变化的PCR引入 PCR随机诱变 易错PCR 随机诱变（ PCR） （3）PCR随机诱变（易错PCR） 定向诱变可以创造缺失、插入、碱基置换、移码突 定向诱变可以创造缺失、插入、碱基置换、 变等不同类型的突变。 变等不同类型的突变。
①RecA重组系统与基因敲除 RecA重组系统与基因敲除 ②Red重组系统与基因敲除 Red重组系统与基因敲除
Red同源重组技术的原理是将一段携带 Red同源重组技术的原理是将一段携带 与靶基因两翼各有40- bp同源序列的 与靶基因两翼各有40-60 bp同源序列的 40 PCR片段导人宿主菌细胞， PCR片段导人宿主菌细胞，利用噬菌体 片段导人宿主菌细胞 Red重组酶的作用， Red重组酶的作用，使导人细胞的线性 重组酶的作用 DNA片段与染色体(或载体) DNA片段与染色体(或载体)的特定靶序 片段与染色体 列进行同源重组， 列进行同源重组，靶基因被标记基因置 换下来。 换下来。
基因工程育种技术
1.同源重组与基因取代技术 1.同源重组与基因取代技术
反向遗传学 是指对病原微生物的cDNA 进行目的性修饰， 是指对病原微生物的cDNA 进行目的性修饰，从而对其进行功能和 表型的分析 正向遗传学主要研究生物突变性状的遗传行为， 正向遗传学主要研究生物突变性状的遗传行为，如控制突变性状的 基因数目及其在染色体上的位置， 基因数目及其在染色体上的位置，以及突变性状在后代中的传递规 律等。 律等。 反向遗传学则是直接从生物的遗传物质入 反向遗传学则是直接从生物的遗传物质入手，利用现代生物理论与 技术，通过核苷酸序列的突变、缺失、插入等手段创造突变体并研 技术，通过核苷酸序列的突变、缺失、 究突变所造成的表型效应，进而来阐述生物生命发生的本质现象， 究突变所造成的表型效应，进而来阐述生物生命发生的本质现象， 与之相关的各种技术统称为反向遗传学技术，主要包括RNA RNA干扰技 与之相关的各种技术统称为反向遗传学技术，主要包括RNA干扰技 基因沉默技术、基因体外转录技术等， DNA重组技术应用范 术、基因沉默技术、基因体外转录技术等，是DNA重组技术应用范 围的扩展与延伸。 围的扩展与延伸。
利用转座子进行基因敲除利用了转座子在染色体上 （2）利用转座子进行基因敲除利用了转座子在染色体上 可移动的特点，当它跳跃插入到某个功能基因时， 可移动的特点，当它跳跃插入到某个功能基因时，就会 引起该基因的失活，并诱导产生突变型。 引起该基因的失活，并诱导产生突变型。 基于PCR PCR方法的基因敲除 （3）基于PCR方法的基因敲除 PCR筛选方法：PCR方法可以用来筛选基因打靶操作中 PCR筛选方法：PCR方法可以用来筛选基因打靶操作中 筛选方法 的阳性克隆。 的阳性克隆。通过在目的突变基因序列中引入特定的 PCR引物序列，利用PCR方法直接检测转化细胞的DNA结 PCR引物序列，利用PCR方法直接检测转化细胞的DNA结 引物序列 PCR方法直接检测转化细胞的DNA 以特定扩增DNA片段的有无， DNA片段的有无 构，以特定扩增DNA片段的有无，鉴别同源重组细胞克 隆。