8酶法分析
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• 近年来，各国对氯霉素残留量的最大允许 限量(ＭＲＬ)日趋苛刻，如：欧盟1mg/kg， 美国和加拿大0.3 mg/kg，日本50 mg/kg，使 原有的方法灵敏度不够，已不能适应于当 前的检测要求。应用ELISA，氯霉素检测下 量达到0.1 mg/kg。
• 将氯霉素与载体牛丙种球蛋白结合，形成具有免疫原性的完 全氯霉素-BGG抗原，并免疫兔三次，一个月后收集兔血清， 纯化出抗氯霉素抗体。 • 将辣根过氧化物酶(HRPO)与氯霉素抗体(CAP)结合,形成氯霉 素结合体(CAP－HRPO)。 • 在已固定抗氯霉素抗体的酶标孔内依次加入两份的氯霉素标 准溶液和不同浓度的蜂蜜样品，37℃反应1h后取出，再加 CAP－HRPO，37 ℃反应1h后取出，加呈色液，反应5~15min 后观察结果并加反应终止液。用酶标仪测定吸光值。 • 美国和加拿大规定蜂蜜中氯霉素的残留量为不大于1mg/kg， 欧盟则为不大于0.1mg/kg，我国尚没有标准。将ELISA方法应 用于蜂蜜中氯霉素残留量的检测，其检测灵敏度为0.3mg/kg， 基本达到国际检测标准要求。
8.2.1 多酶偶联测定法
• 当被分析的底物或反应产物没有易于检测 的常规手段时，可采用两种或两种以上的 酶进行连续式或平行式的偶联反应，使底 物通过两步或多步反应，转化为易于检测 的产物，从而测定待测物质的含量。偶联 的酶主要有脱氢酶和氧化酶。其中应用最 广泛的是以ＮＡＤ(辅酶Ⅰ)或ＮＡＤＰ(辅 酶Ⅱ)为辅酶的脱氢酶类。
ELISA常用的测定方法
• 直接法和间接法两种: • 直接法是酶标记抗体与待检测样本中固相抗原直接作 用，加入底物后，显色(其颜色深浅与样本中抗原量成 正比)； • 间接法是使已知抗原吸附在固相载体上，与待检测样 本中的抗体作用，再加入酶标记抗同种动物抗体的免 疫球蛋白(抗抗体)，使与特异抗原抗体复合物中的抗体 作用，加入酶底物，显色(颜色深浅与样本中抗体量成 正比)。 • 本法具有可定量、反应灵敏准确、标记物稳定、适用 范围宽、检测速度快以及费用低等特点。近年本技术 得到了快速的发展，特别是广泛应用在快速检测上
例1:葡萄糖的定量测定
己糖激酶 葡萄糖+ATP 葡萄糖-6-磷酸+ADP 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 +NADP
6-磷酸葡萄糖d内脂 + NADPH＋H＋ 若将以上两个酶反应偶联，则葡萄糖的减少量与 NADPH的生成量成一定比例。NADPH在340nm波长处 有特征最大吸收峰，而NADP则无光吸收。因此，通过 测定340nm波长处吸光度的变化，就可以对葡萄糖进行 定量分析。
8.1.3 被测化合物是酶的辅因
子或抑制剂
• 如果待测物质可作为某种酶专一的辅酶或抑制剂，则这 种物质的浓度和将其作为辅酶或抑制剂的酶的反应速度 之间有一定关联，因此通过测定该酶的反应速度就能进 行这种物质的定量。 • 此法可用于嘌呤、核苷酸、维生素、辅酶和食品中农药、 杀虫剂的检测。同样，利用那些活性金属离子决定的酶 也可进行相应无机金属离子的检定。 辅酶或抑制剂 待测物质 产物
（1）以碘代硫化乙酰胆碱作为底物
5.5’－二硫代2.2’－二硝基苯甲酸（DTNB）作为显色剂。 碘代硫化乙酰胆碱 乙酰胆碱酯酶 有机磷农药 碘代硫化胆碱
DTNB
5－巯基－硝基苯甲酸 （黄色） 于410nm波长处测定溶液的吸光度变化
• 通过比较特定的酶催化显色反应动力学曲线， 直接显示有机磷和氨基甲酸酯类农药对乙酰胆 碱的抑制率，并以其来反映样品受农药污染的 程度。 • 现已有依据这一原理研制出便携式残留毒性快 速测定仪。敌敌畏的检出限为2.2×10－5ug/ml。 此方法可以对大量农产品中农药残留超标或不 超标进行快速筛选，亦可进行农药残留的定量 分析。
8.2.4
酶标免疫检测法
• 抗体与相应的抗原具有选择和结合的双重功 能。通过测定复合物中酶的含量可得出待测 抗原的含量。酶标免疫检测法可用于食品的 污染检测中，尤其适用于毒素的快速检测。
酶 + 抗体 酶标抗体 待测抗原 酶—抗体—抗原复合物
8.2.5 酶联免疫吸附检测法
• 酶联免疫吸附检测法(Enzyme-Linked lmmunosorbent Assay 简称ELISA)是将酶分子与抗体分子连接成一个酶标分子， 当它与固相免疫吸附中相应抗原或抗体复合物相遇时形成 酶－抗原－抗体结合物，加入酶底物，底物被催化成可溶 性或不溶性显色产物，可用肉眼或分光光度计定性或定量， 这对酶标记抗体技术是一个发展。 • 酶联免疫吸附测定法主要针对小分子量（<2500）的农药， 因为大分子量的农药可以直接作为抗原免疫动物产生抗体， 小分子量的泻药属于半抗原，一般不具有免疫动物产生抗 体，因而要与分子量大的载体偶联，制备人工抗原，以人 工抗原的形式贸易商动物产生抗体。
• 不必控制影响酶反应初速度的pH和温度等许多参数， 而只需要保证酶反应进行完全。 • 例如，在乳酸脱氢酶催化反应中， 乳酸＋NAD＋ 丙酮酸＋NADH 一种方法可以加入过量的反应物NAD（P），通常是 使它的浓度达到被测组分的浓度的5至10倍；另一种方 法，可以加入肼除去产物丙酮酸，使反应向产物方向 进行。另外，可以在完全相同的反应条件下，制作标 准曲线，然后通过标准曲线得到待测化合物的浓度。
在某些情况下，酶催化反应不能进行完全就已达到平衡， 此时可以通过提高反应物浓度或去除反应的某一产物，从而 打破平衡，使其向有利于产物的方向进行。
8.1.2 动力学测定法
• 根据测量转化速率，以得到底物浓度。 • 测定的参数可以是吸光度、荧光度、pＨ值等。初 速度V0和底物的原始浓度[S 0]不是线性的，而是一 条曲线。以1/ V0对1/ [S 0]作图制作标准曲线，然 后从标准曲线测定待测物浓度。
第8章 酶在食品分析中的应用
前言 8.1 8.2 8.3 8.4 概念、优点、局限性 酶法测定的基本原理 酶法分析技术 酶指示剂分析食品热烫和灭菌效果 固定化酶和酶电极
酶法分析的概念、优点、局限性
酶分析的概念
酶分析就是通过对酶反应的测定来达到化 学分析和临床检定目的的一类分析方法。
它分为两种类型： ① 以酶为分析对象的分析，称为酶活力的测定； ② 以酶为分析工具的分析，称为酶法分析。
酶法测定的基本原理
8.1 酶法测定的基本原理
终点测定法 动力学的方法 作为酶的抑制剂 测定食品中的酶活力
作为酶的底物 测定食品成分
8.1.1 终点测定法
• 是酶法分析的应用最广泛的一种方法。 • 原理：在以待测物质为底物的酶反应中，如果使底 物能够接近完全地转化为产物，而且底物或产物又 具有某种特征性质，通过直接测定转化前后底物的 减少量、产物的增加量或辅酶的变化等就可以定量 待测物。 接近完全地转化 待测物质 酶 产物
（4）选用乙酸萘酯作为底物
• a-乙酸萘酯＋水
胆碱酯酶 有机磷农药
萘酚＋乙酸 固蓝B 显色产物
• 在680nm波长处测定吸光度。检出限在 mg/kg级别。不可检出氨基甲酸酯类农药。
酶法分析技术的种
类及其基本原理
龙肇. 马硕
8.2 酶法分析技术
8.2.1 多酶偶联测定法 8.2.2 通过酶反应循环系统的高灵敏度测定法 8.2.3 放射性同位素测定法 8.2.4 酶标免疫检测法 8.2.5 酶联免疫吸附检测法
下图是根据反应前后酶反应体系的吸光度或荧光 强度的总变化，测定产物（或底物）的量。 （1） CA、CB和CC 3个底物浓度对吸光度 变化的影响，吸光度最 初变化快，以致反应在 几分钟内即可完成。此 方法仅需知道最初和最 终吸光度； （2）根据（1）中的数 据，得到底物浓度和吸 光度总变化的相关图
终点法的优点
酶
例如
• 利用有机磷及氨基甲酸酯类农药对乙酰胆碱酯酶 （acetychdine Esterase）的特异性抑制作用，目前已 广泛应用酶化学分析方法测定痕量和微量有机磷及 氨基甲酸酯类的残留。 • 乙酰胆碱酯酶可以催化乙酰胆碱，且同时它也可以 催化水解其他一些羧酸酯，产生色差反应。当农药 抑制了胆碱酯酶，则反应不能进行。 有机磷及 抑制 乙酰胆碱酯酶 氨基甲酸 乙酰胆碱 有色物质 酯类农药
8.2.5.2 ELISA在食品中检测的应用
（1）检测食品中的毒素 （2）检测食品中的残留农药 （3）检测食品中的微生物 （4）检测食品中的其它成分
（1）检测食品中的毒素
• 目前发现能引起人中毒的霉菌代谢产物至少有150种 以上，常见的产毒性真菌有曲霉菌属、青霉菌属、 镰刀菌属等，其中最常见且研究最多的是黄曲霉毒 素、超曲霉毒素等。 • 例如 有报道利用免疫吸附方法测定酱油中黄曲霉 毒素Ｂ1，过去多以限量法，指标仅限于小于、等于 5ug/kg，对于超过此值的样品，需作确证试验，手 续更为繁杂，且不能准确定量。 • 按ELISA法可大大提高样品阳性检出率，在扫描仪 上可直接测出数据。
8.2.3 放射性同位素测定法
• 酶的活性可以采用同位素标记的底物进行测 量，经酶解后产生放射性的产物，随时间所 生成的放射性产物含量与酶的浓度成正比。 此外，用放射性同位素的底物经酶的作用后 得到的产物，经适当分离测定产物的同位素 含量。此法可用于需要进行极微量的分析或 因新发现的酶还未找到适当的分析法时的测 定。用于测定的放射性同位素一般有3Ｈ、 14Ｃ、32Ｐ、35Ｓ。
Vmax[S0] Km+ [S0]
n0＝
该方法特点
• • • • • • 测定速度快； 试剂用量少，成本低； 对浊度和色素的干扰不敏感； 不需要考虑反应是否进行完全； 有利于自动分析。 对裂解酶和异构酶特别适宜，当水含量 保持不变时，水解酶催化的水解反应也 可以认为是单底物反应。
该方法不足
• 对反应的条件（如酶浓度、pH和温度） 要求严格，待测物的测定和标准曲线制 作的条件要求完全相同。 • 要求分析使用的酶具有高的Km，以便测 定较高的底物浓度。 • 准确度相对较差。
8.2.5.1 酶联免疫吸附的原理与方法
原理：
(含抗体 酶标抗原（或抗 ＋待测样品 体）固相载体 或抗原) 经洗涤去除反应液中其他物质
通过定性或定量分析有色产物量 即可确定样品中待测物质含量
Βιβλιοθήκη Baidu
免疫复 合物
酶反应底物 有色产物
固相载体上酶标抗原或抗体被结合量(免疫复合物) 即与标本中待检抗体或抗原的量成一定比例。
（2）氯化乙酰胆碱
氯化乙酰胆碱 胆碱酯酶 有机磷农药
醋酸 pH指示剂 定性或半定量分析。
（3）植物酯酶水解2,6－二氯乙酰锭酚
• 植物酯酶促使底物2,6－二氯乙酰锭酚分解
有机磷农药
根据反应溶液水解前后颜色的变化，通过辨别农药对 酶抑制程度，间接观察农残情况。
• 此法操作简单，测定快速，很适合于水 中和市售新鲜蔬菜进行农残快速检测。 检测限在0.029mg/L～10 mg/L。
检测罂粟壳等毒品
• 目前，市场上出现了在食品中渗入罂粟壳等 毒品，而现有方法如比色法、极谱法、色谱 法和免疫分析法无法有效监测样品，而酶联 免疫测定方法灵敏度高，特异性强，操作方 便，能快速监测。 • 利用酶联免疫测定法测定，最小检出浓度为 5.0ng/mL，具有十分明显的社会和经济效益。
（2） 检测食品中的残留农药
•
该法的原理是
SOD亚硫酸 盐氧化酶
存84天。
通过酶反应循环系统的高 灵敏度测定法
8.2.2
A＋B C＋D A＋Y C＋X • 如果待测底物Ａ的量极微，无法直接测定时，可 将以上两式偶联，构成一个酶反应循环系统，将 Ａ的产物Ｃ再变成Ａ，如此经过多次循环，产物 Ｄ的量将随反应时间不断积累而增多；如果选择 适当的反应条件，在一定时间后使循环反应停止 时，Ｄ的生成量将与被测物质Ａ的最初浓度成比 例。对于不能直接测量的微量物质Ａ，经过循环 反应后，通过测量Ｄ就能定量微量的Ａ。
酶法分析的优点
被测样品无需预先提取分离； 为什么？专一性！
不破坏被测物质； 为什么？
常温、高效、温和！
酶法分析可测定化学分析无法分析的内容。
为什么？ 酶的广泛分布、种类多！
酶法分析的局限性
① 需要有适宜的、高纯度的、高比活力的工
具酶，因而代价较高； ② 工具酶在酶法分析中只起一种温和而专一 的预处理作用，最终测定仍需采用化学方 法或物理化学方法。
食品酶学分析中采用终点法所需 要的某些酶的浓度
底物 葡萄糖 甘油 尿酸 延胡索酸 酶 已糖激酶 甘油激酶 尿酸氧化酶 延胡索酸酶 Km 1.0×10-4(30℃) 5.0×10-5(25℃) 1.7×10-5(20℃) 1.7×10-6(21℃) 酶浓度 /(IU/L) 1.67 0.83 0.28 0.03
• 将氯霉素与载体牛丙种球蛋白结合，形成具有免疫原性的完 全氯霉素-BGG抗原，并免疫兔三次，一个月后收集兔血清， 纯化出抗氯霉素抗体。 • 将辣根过氧化物酶(HRPO)与氯霉素抗体(CAP)结合,形成氯霉 素结合体(CAP－HRPO)。 • 在已固定抗氯霉素抗体的酶标孔内依次加入两份的氯霉素标 准溶液和不同浓度的蜂蜜样品，37℃反应1h后取出，再加 CAP－HRPO，37 ℃反应1h后取出，加呈色液，反应5~15min 后观察结果并加反应终止液。用酶标仪测定吸光值。 • 美国和加拿大规定蜂蜜中氯霉素的残留量为不大于1mg/kg， 欧盟则为不大于0.1mg/kg，我国尚没有标准。将ELISA方法应 用于蜂蜜中氯霉素残留量的检测，其检测灵敏度为0.3mg/kg， 基本达到国际检测标准要求。
8.2.1 多酶偶联测定法
• 当被分析的底物或反应产物没有易于检测 的常规手段时，可采用两种或两种以上的 酶进行连续式或平行式的偶联反应，使底 物通过两步或多步反应，转化为易于检测 的产物，从而测定待测物质的含量。偶联 的酶主要有脱氢酶和氧化酶。其中应用最 广泛的是以ＮＡＤ(辅酶Ⅰ)或ＮＡＤＰ(辅 酶Ⅱ)为辅酶的脱氢酶类。
ELISA常用的测定方法
• 直接法和间接法两种: • 直接法是酶标记抗体与待检测样本中固相抗原直接作 用，加入底物后，显色(其颜色深浅与样本中抗原量成 正比)； • 间接法是使已知抗原吸附在固相载体上，与待检测样 本中的抗体作用，再加入酶标记抗同种动物抗体的免 疫球蛋白(抗抗体)，使与特异抗原抗体复合物中的抗体 作用，加入酶底物，显色(颜色深浅与样本中抗体量成 正比)。 • 本法具有可定量、反应灵敏准确、标记物稳定、适用 范围宽、检测速度快以及费用低等特点。近年本技术 得到了快速的发展，特别是广泛应用在快速检测上
例1:葡萄糖的定量测定
己糖激酶 葡萄糖+ATP 葡萄糖-6-磷酸+ADP 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 +NADP
6-磷酸葡萄糖d内脂 + NADPH＋H＋ 若将以上两个酶反应偶联，则葡萄糖的减少量与 NADPH的生成量成一定比例。NADPH在340nm波长处 有特征最大吸收峰，而NADP则无光吸收。因此，通过 测定340nm波长处吸光度的变化，就可以对葡萄糖进行 定量分析。
8.1.3 被测化合物是酶的辅因
子或抑制剂
• 如果待测物质可作为某种酶专一的辅酶或抑制剂，则这 种物质的浓度和将其作为辅酶或抑制剂的酶的反应速度 之间有一定关联，因此通过测定该酶的反应速度就能进 行这种物质的定量。 • 此法可用于嘌呤、核苷酸、维生素、辅酶和食品中农药、 杀虫剂的检测。同样，利用那些活性金属离子决定的酶 也可进行相应无机金属离子的检定。 辅酶或抑制剂 待测物质 产物
（1）以碘代硫化乙酰胆碱作为底物
5.5’－二硫代2.2’－二硝基苯甲酸（DTNB）作为显色剂。 碘代硫化乙酰胆碱 乙酰胆碱酯酶 有机磷农药 碘代硫化胆碱
DTNB
5－巯基－硝基苯甲酸 （黄色） 于410nm波长处测定溶液的吸光度变化
• 通过比较特定的酶催化显色反应动力学曲线， 直接显示有机磷和氨基甲酸酯类农药对乙酰胆 碱的抑制率，并以其来反映样品受农药污染的 程度。 • 现已有依据这一原理研制出便携式残留毒性快 速测定仪。敌敌畏的检出限为2.2×10－5ug/ml。 此方法可以对大量农产品中农药残留超标或不 超标进行快速筛选，亦可进行农药残留的定量 分析。
8.2.4
酶标免疫检测法
• 抗体与相应的抗原具有选择和结合的双重功 能。通过测定复合物中酶的含量可得出待测 抗原的含量。酶标免疫检测法可用于食品的 污染检测中，尤其适用于毒素的快速检测。
酶 + 抗体 酶标抗体 待测抗原 酶—抗体—抗原复合物
8.2.5 酶联免疫吸附检测法
• 酶联免疫吸附检测法(Enzyme-Linked lmmunosorbent Assay 简称ELISA)是将酶分子与抗体分子连接成一个酶标分子， 当它与固相免疫吸附中相应抗原或抗体复合物相遇时形成 酶－抗原－抗体结合物，加入酶底物，底物被催化成可溶 性或不溶性显色产物，可用肉眼或分光光度计定性或定量， 这对酶标记抗体技术是一个发展。 • 酶联免疫吸附测定法主要针对小分子量（<2500）的农药， 因为大分子量的农药可以直接作为抗原免疫动物产生抗体， 小分子量的泻药属于半抗原，一般不具有免疫动物产生抗 体，因而要与分子量大的载体偶联，制备人工抗原，以人 工抗原的形式贸易商动物产生抗体。
• 不必控制影响酶反应初速度的pH和温度等许多参数， 而只需要保证酶反应进行完全。 • 例如，在乳酸脱氢酶催化反应中， 乳酸＋NAD＋ 丙酮酸＋NADH 一种方法可以加入过量的反应物NAD（P），通常是 使它的浓度达到被测组分的浓度的5至10倍；另一种方 法，可以加入肼除去产物丙酮酸，使反应向产物方向 进行。另外，可以在完全相同的反应条件下，制作标 准曲线，然后通过标准曲线得到待测化合物的浓度。
在某些情况下，酶催化反应不能进行完全就已达到平衡， 此时可以通过提高反应物浓度或去除反应的某一产物，从而 打破平衡，使其向有利于产物的方向进行。
8.1.2 动力学测定法
• 根据测量转化速率，以得到底物浓度。 • 测定的参数可以是吸光度、荧光度、pＨ值等。初 速度V0和底物的原始浓度[S 0]不是线性的，而是一 条曲线。以1/ V0对1/ [S 0]作图制作标准曲线，然 后从标准曲线测定待测物浓度。
第8章 酶在食品分析中的应用
前言 8.1 8.2 8.3 8.4 概念、优点、局限性 酶法测定的基本原理 酶法分析技术 酶指示剂分析食品热烫和灭菌效果 固定化酶和酶电极
酶法分析的概念、优点、局限性
酶分析的概念
酶分析就是通过对酶反应的测定来达到化 学分析和临床检定目的的一类分析方法。
它分为两种类型： ① 以酶为分析对象的分析，称为酶活力的测定； ② 以酶为分析工具的分析，称为酶法分析。
酶法测定的基本原理
8.1 酶法测定的基本原理
终点测定法 动力学的方法 作为酶的抑制剂 测定食品中的酶活力
作为酶的底物 测定食品成分
8.1.1 终点测定法
• 是酶法分析的应用最广泛的一种方法。 • 原理：在以待测物质为底物的酶反应中，如果使底 物能够接近完全地转化为产物，而且底物或产物又 具有某种特征性质，通过直接测定转化前后底物的 减少量、产物的增加量或辅酶的变化等就可以定量 待测物。 接近完全地转化 待测物质 酶 产物
（4）选用乙酸萘酯作为底物
• a-乙酸萘酯＋水
胆碱酯酶 有机磷农药
萘酚＋乙酸 固蓝B 显色产物
• 在680nm波长处测定吸光度。检出限在 mg/kg级别。不可检出氨基甲酸酯类农药。
酶法分析技术的种
类及其基本原理
龙肇. 马硕
8.2 酶法分析技术
8.2.1 多酶偶联测定法 8.2.2 通过酶反应循环系统的高灵敏度测定法 8.2.3 放射性同位素测定法 8.2.4 酶标免疫检测法 8.2.5 酶联免疫吸附检测法
下图是根据反应前后酶反应体系的吸光度或荧光 强度的总变化，测定产物（或底物）的量。 （1） CA、CB和CC 3个底物浓度对吸光度 变化的影响，吸光度最 初变化快，以致反应在 几分钟内即可完成。此 方法仅需知道最初和最 终吸光度； （2）根据（1）中的数 据，得到底物浓度和吸 光度总变化的相关图
终点法的优点
酶
例如
• 利用有机磷及氨基甲酸酯类农药对乙酰胆碱酯酶 （acetychdine Esterase）的特异性抑制作用，目前已 广泛应用酶化学分析方法测定痕量和微量有机磷及 氨基甲酸酯类的残留。 • 乙酰胆碱酯酶可以催化乙酰胆碱，且同时它也可以 催化水解其他一些羧酸酯，产生色差反应。当农药 抑制了胆碱酯酶，则反应不能进行。 有机磷及 抑制 乙酰胆碱酯酶 氨基甲酸 乙酰胆碱 有色物质 酯类农药
8.2.5.2 ELISA在食品中检测的应用
（1）检测食品中的毒素 （2）检测食品中的残留农药 （3）检测食品中的微生物 （4）检测食品中的其它成分
（1）检测食品中的毒素
• 目前发现能引起人中毒的霉菌代谢产物至少有150种 以上，常见的产毒性真菌有曲霉菌属、青霉菌属、 镰刀菌属等，其中最常见且研究最多的是黄曲霉毒 素、超曲霉毒素等。 • 例如 有报道利用免疫吸附方法测定酱油中黄曲霉 毒素Ｂ1，过去多以限量法，指标仅限于小于、等于 5ug/kg，对于超过此值的样品，需作确证试验，手 续更为繁杂，且不能准确定量。 • 按ELISA法可大大提高样品阳性检出率，在扫描仪 上可直接测出数据。
8.2.3 放射性同位素测定法
• 酶的活性可以采用同位素标记的底物进行测 量，经酶解后产生放射性的产物，随时间所 生成的放射性产物含量与酶的浓度成正比。 此外，用放射性同位素的底物经酶的作用后 得到的产物，经适当分离测定产物的同位素 含量。此法可用于需要进行极微量的分析或 因新发现的酶还未找到适当的分析法时的测 定。用于测定的放射性同位素一般有3Ｈ、 14Ｃ、32Ｐ、35Ｓ。
Vmax[S0] Km+ [S0]
n0＝
该方法特点
• • • • • • 测定速度快； 试剂用量少，成本低； 对浊度和色素的干扰不敏感； 不需要考虑反应是否进行完全； 有利于自动分析。 对裂解酶和异构酶特别适宜，当水含量 保持不变时，水解酶催化的水解反应也 可以认为是单底物反应。
该方法不足
• 对反应的条件（如酶浓度、pH和温度） 要求严格，待测物的测定和标准曲线制 作的条件要求完全相同。 • 要求分析使用的酶具有高的Km，以便测 定较高的底物浓度。 • 准确度相对较差。
8.2.5.1 酶联免疫吸附的原理与方法
原理：
(含抗体 酶标抗原（或抗 ＋待测样品 体）固相载体 或抗原) 经洗涤去除反应液中其他物质
通过定性或定量分析有色产物量 即可确定样品中待测物质含量
Βιβλιοθήκη Baidu
免疫复 合物
酶反应底物 有色产物
固相载体上酶标抗原或抗体被结合量(免疫复合物) 即与标本中待检抗体或抗原的量成一定比例。
（2）氯化乙酰胆碱
氯化乙酰胆碱 胆碱酯酶 有机磷农药
醋酸 pH指示剂 定性或半定量分析。
（3）植物酯酶水解2,6－二氯乙酰锭酚
• 植物酯酶促使底物2,6－二氯乙酰锭酚分解
有机磷农药
根据反应溶液水解前后颜色的变化，通过辨别农药对 酶抑制程度，间接观察农残情况。
• 此法操作简单，测定快速，很适合于水 中和市售新鲜蔬菜进行农残快速检测。 检测限在0.029mg/L～10 mg/L。
检测罂粟壳等毒品
• 目前，市场上出现了在食品中渗入罂粟壳等 毒品，而现有方法如比色法、极谱法、色谱 法和免疫分析法无法有效监测样品，而酶联 免疫测定方法灵敏度高，特异性强，操作方 便，能快速监测。 • 利用酶联免疫测定法测定，最小检出浓度为 5.0ng/mL，具有十分明显的社会和经济效益。
（2） 检测食品中的残留农药
•
该法的原理是
SOD亚硫酸 盐氧化酶
存84天。
通过酶反应循环系统的高 灵敏度测定法
8.2.2
A＋B C＋D A＋Y C＋X • 如果待测底物Ａ的量极微，无法直接测定时，可 将以上两式偶联，构成一个酶反应循环系统，将 Ａ的产物Ｃ再变成Ａ，如此经过多次循环，产物 Ｄ的量将随反应时间不断积累而增多；如果选择 适当的反应条件，在一定时间后使循环反应停止 时，Ｄ的生成量将与被测物质Ａ的最初浓度成比 例。对于不能直接测量的微量物质Ａ，经过循环 反应后，通过测量Ｄ就能定量微量的Ａ。
酶法分析的优点
被测样品无需预先提取分离； 为什么？专一性！
不破坏被测物质； 为什么？
常温、高效、温和！
酶法分析可测定化学分析无法分析的内容。
为什么？ 酶的广泛分布、种类多！
酶法分析的局限性
① 需要有适宜的、高纯度的、高比活力的工
具酶，因而代价较高； ② 工具酶在酶法分析中只起一种温和而专一 的预处理作用，最终测定仍需采用化学方 法或物理化学方法。
食品酶学分析中采用终点法所需 要的某些酶的浓度
底物 葡萄糖 甘油 尿酸 延胡索酸 酶 已糖激酶 甘油激酶 尿酸氧化酶 延胡索酸酶 Km 1.0×10-4(30℃) 5.0×10-5(25℃) 1.7×10-5(20℃) 1.7×10-6(21℃) 酶浓度 /(IU/L) 1.67 0.83 0.28 0.03