改良的人脐带间充质干细胞培养方法

摘 要 目的： 建立人脐带间充质干细胞（ hUCMSCs） 的分离和培养方法，探讨 hUCMSCs 的成脂成骨分化潜能。方 法： 用酶消化法、传统组织块法和改良组织块法从人脐带中分离间充质干细胞，流式细胞仪检测其免疫表型； 用不同 的培养体系诱导 hUCMSCs 向成骨细胞及成脂细胞分化，并对其进行鉴定。结果： 改良的 hUCMSCs 培养方法培养细胞 纯度更高，在相同的培养时间内，改良组织块法所获得的细胞数量是酶消化法的 2 ～ 3 倍，是传统组织块法的 20 ～ 30 倍，细胞呈长梭形生长； 高表达 CD73、CD90、CD44、CD105，不表达 CD31、CD45、CD34 ； 茜素红染色及油红 O 染色证实 了 hUCMSCs 可分化为脂肪细胞和成骨细胞。结论： 建立了 hUCMSCs 的培养新方法，证实了 hUCMSCs 的增殖能力和 多向分化潜能，为其治疗应用提供支持。 关键词 人脐带间充质干细胞 细胞培养 免疫表型 诱导分化 doi： 10． 3969 / j． issn． 1004 － 8189． 2012． 12
1． 1 材料来源 正常健康顺产男婴脐带组织（ 来自湖北省武汉
市同济生殖专科医院） ，经产妇知情同意。实验方 案经医院伦理委员会批准。 1． 2 主要试剂及仪器
低糖 DMEM 培养基 （ 美国 GIBCO 公司） ，高糖 DMEM 培养基 （ 美国 GIBCO 公司） ，胎牛血清 FBS （ 美国 GBICO 公司） ，双抗（ 青霉素 － 链霉素，美国 GIBCO 公司） ，地塞米松、β － 甘油磷酸钠等 （ 美国 Sigma） ，APC、PE 或 FITC 标 记 的 CD73、CD105、 CD45、CD90、CD44、CD31、CD34 。 1． 3 hUCMSCs 的分离与培养
型和更具潜力的间充质干细胞已成为研究热点之 一。人脐带间充质细胞（ hUCMSCs） 已经在神经疾 病［6，7］、癌症［8］、糖 尿 病［9］、心 脏 病 等 动 物 模 型 中 证 实有治疗效果。若进一步应用于临床，最重要的就 是体外扩增达到有效的临床治疗剂量［10］，其次是保 证细 胞 的 特 性，免 疫 抑 制 能 力［11］，多 向 分 化 潜
中国计划生育学杂志 2013 年 1 月 第 21 卷 第 1 期 Chin J Fam Plann，Vol． 21，No． 1，January 2013
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能［12］。鉴于此，本文从培养 hUCMSCs 的方法学入 手，力求能有效地扩增出足够数量的间充质干细胞， 为临床应用提供细胞来源。
1 材料和方法
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·技术与方法·
改良的人脐带间充质干细胞培养方法
郝白露 杨瑞峰Βιβλιοθήκη Baidu彭祥炽 赵 凯 李红钢 胡 廉 熊承良*
华中科技大学同济医学院计划生育研究所 / 生殖医学中心（ 武汉，430030）
间充质干细胞是普遍存在于不同组织的多潜能 成体干细 胞［1］，可 刺 激 组 织 生 长 和 修 复［2］，增 强 组 织的再生能 力，影 响 免 疫 调 节［3］，在 细 胞 治 疗 领 域 有着极为 广 阔 的 应 用 前 景［4］。 尽 管 间 充 质 干 细 胞 表达一些已知的表面标志物，但至今尚未发现特异 性的表面标志基因，为了解决这一问题，国际细胞治 疗学会提出 3 个最低标准定义间充质干细胞： ①在
The modified culture method of human umbilical cord mesenchymal stem cells Hao Bailu，Yang Ruifeng，Peng Xiangzhi，Zhao Kai，Xiong Chengliang* Reproductive Medical Center / Research Institute for Family Planning，Tongji Medical College of Huazhong University of Science ＆ Technology，Wuhan 430030 * Corresponding author： Xiong Chengliang： clxiong951@ sina． com Abstract Objective： To establish a method to isolate and culture human umbilical cord mesenchymal stem cells （ hUCMSCs） in vitro and to study hUCMSCs＇ differentiation potential towards osteoblasts and lipoblasts． Methods： Mesenchymal stem cells were isolated from human umbilical cord by enzyme digestion，conventional tissue adherence and modified tissue adherence． The immunophenotypes were detected by flow cytometry． The cells were induced to differentiate into osteoblasts and lipoblasts by different culture systems． Results： The modified culture method of hUCMSCs was established． The cells were of higher purity，and the primary cell number was 2 － 3 times as that achieved with conventional enzyme digestion method and 20 － 30 times as that of conventional tissue block culture． The adherent cells showed a spindle shape and were positive for CD73， CD90，CD44 and CD105，but negative for CD31，CD45 and CD34． After induction，the differentiated cells were positive for alizarin red staining and oil red O staining． Conclusion： An effectively culture method of hUCMSCs was established，and the cells can differentiate into osteoblasts and lipoblasts． Key words Human umbilical cord mesenchymal stem cells； Cell culture； Immunophenotype； Induction and differentiation
采 集 脐 带 后，放 入 运 输 液 中 （ 100ml 低 糖 DMEM、1ml 双抗、1μg / ml 两性霉素） 低温保存，带回 实验室 12h 内进行处理。将脐带置于超净工作台， 剥去动静脉，用 PBS 洗去残留的血液，用不同方法 培养细胞，观察细胞的生长、变化［13，14］。 1． 3． 1 原代培养 ①酶消化法： 剪碎处理过的组织， 加入适量 1mg / ml 胶原酶 II 混匀，放入 CO2 培养箱 中，37℃ ，12h。后加入胰蛋白酶，37℃ ，10min。将液 体加入离心管中，以 ＞ 2 000r / min 离心 10min，将沉 淀物用完全培养液 （ 低糖 DMEM、10% FBS、1ml 双 抗） 重悬，移入 10 个培养瓶中培养［10］。倒置显微镜 下观察，细胞贴壁后半量换液，弃去未贴壁的细胞。 当细胞达到 80% ～ 90% 融合度，用胰蛋白酶消化传 代。②传统组织块法： 在去血管后的组织上剪取 1 ～ 3mm3 组 织 块 小 心 放 入 T25 培 养 瓶 底 部，间 隔 0. 5cm，每个瓶中放置约 30 个小块，共放置 10 个培 养瓶。向培养瓶中加入 250μl 完全培养液（ 湿润组 织块底部即可） ，置于 37℃ 、5% CO2 培养箱中孵育。 于第 3 天加入完全培养基 3ml，以后隔天观察细胞， 并根据情况换液，当细胞达到 80% ～ 90% 融 合 度 时，将贴 壁 细 胞 消 化 传 代 。 ［5，13，15，16］ ③ 改 良 组 织 块 法： 用微量加样器取少量培养液到 T25 培养瓶中润 湿培养瓶底部，弃去多余的培养液，在去血管后的组 织上，取 1 ～ 3mm3 组织块，以 0． 5cm 的间距放置到 湿润了的 T25 培养瓶中，每个瓶中放置约 30 个组织
项目基金： 湖北省科技厅研究与开发项目（ 2008BCC007） 收稿日期： 2012 － 06 － 06 修回日期： 2012 － 10 － 18 * 通讯作者： clxiong951@ sina． com
标准培养条件下可贴附于塑料器皿； ②表达 CD105、 CD73、CD109，并且不表达造血细胞标志物如 CD45、 CD34、CD14、CD11b； ③在体外培养条件下能够向成 骨细胞、脂 肪 细 胞、成 软 骨 细 胞 分 化［5］。 骨 髓 间 充 质干细胞已经在临床上得到了应用，近几年寻找新
块，共放置 10 个培养瓶。置于 37℃ 、5% CO2 培养 箱中孵育，以后每天用 300μl 的培养液湿润组织块， 再弃去多余的液体，当有细胞从组织块中游出后，逐 渐向培养瓶中增加培养液（ 但避免组织块漂起） ，当 达到 80% ～ 90% 融合度时，将贴壁细胞和组织块分 别传代。 1． 3． 2 改进的传代培养 ①贴壁细胞传代： 加入胰 蛋白酶 2ml，待细胞悬浮后用 2 倍体积的完全培养 基终止消化，以 1 500r / min 离心 10min，弃上清。用 完全培养基重悬细胞转入 T25 培养瓶中，每个培养 瓶中补足 3ml 培养液，以后每周换 2 次液。②组织 块传代： 将有细胞游出的组织块小心挑出，移入新的 培养皿，间隔 5mm 种植，加少量完全培养基湿润底 部即可，待 其 贴 壁 后 再 补 加 一 定 量 的 完 全 培 养 基。 待观察到有细胞从组织块游出后，隔天换液，待游出 组织块细胞达到一定密度后传代。 1． 3． 3 免疫表型鉴定 取第 3 代细胞，消化细胞后 离心弃去上清液，加 PBS 洗 2 次，用 PBS 重悬细胞 分装到 10 个 1． 5ml EP 管中，使每管的细胞量达到 107 个、液体量为 100μl，避光。分别加入 5μl APC、 PE 或 FITC 标 记 的 CD73、CD105、CD90、CD44、 CD45、CD31、CD34，以及 FITC、PE 的同型对照和空 白对 照。4℃ 孵 育 30min 后，用 1ml PBS 洗 2 遍， 1 500r / min 离心 10min，200μl PBS 重悬细胞，流式 细胞仪检测分析。 1． 3． 4 细胞的多向分化潜能及其鉴定 消化体外扩 增的第 3 代细胞，以 1 ︰ 2 的比例传代到 6 孔板中， 待其达到 70% ～ 80% 融合度时，将培养液换为成骨 诱导分化培养液 （ 用高糖 DMEM 配置的完全培养 基、0． 1μmol / L 地 塞 米 松、50μmol / L 抗 坏 血 酸、 10mmol / L β － 磷酸甘油） ［17］及成脂诱导分化培养 液（ 用高糖 DMEM 配置的完全培养基： 1μmol / L 地 塞米松、200μmol / L 吲哚美辛、10μg / ml 胰岛素、异 丁基甲基黄嘌呤） ，每 4 天半量换液，于 3 周后行茜 素红、油红 O 染色进行鉴定。以未加诱导液只用高 糖 DMEM 配制的完全培养基培养的 hUCMSCs 作为 阴性对照组同时进行染色［17］。