在单一提取系统中同时测定五种植物抗氧化酶

在单一提取系统中同时测定五种植物抗氧化酶

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李忠光1,　李江鸿2,　杜朝昆1,　黄号栋1,　龚　明1

(1.云南师范大学生命科学学院,云南昆明650092;2.思茅高等师范专科学校,云南思茅665000)

摘　要:　文章介绍了在一个单一酶提取系统中同时提取并测定五种抗氧化酶。通过对酶测定反应的动力学分析,确定了各个酶测定的适宜参数。这一提取和测定系统使多种抗氧化酶的提取变得简便快速,并使酶活性测定结果有较好的准确性、重复性和可比性。关　键　词:　单一提取系统;抗氧化酶系统;动力学曲线;酶活性

中图分类号:　946.5 文献标识码:　A 文章编号:　1007-9793(2002)06-44-05

植物细胞在其生命活动过程中,由于叶绿体、线粒体和质膜上每时每刻发生的电子传递过程中的电子泄漏,而不可避免地总会产生大量的活性氧。活性氧会导致生物大分子及膜系统的过氧化反应而损伤细胞。但植物细胞具有由多种抗氧化剂分子及抗氧化酶所组成的抗氧化系统,从而将活性氧控制在细胞可忍耐的水平[1-4]

。植物抗氧化酶系统有一系列的抗氧化酶如超氧化物歧化酶(SOD )、过氧化氢酶(CA T )、抗坏血酸专一性过氧化物酶(APX )、愈创木酚过氧化物酶(GPX )、谷胱甘肽还原酶(GR )等组成[1-4]。通过各抗氧化酶的协同作用,可把细胞内产生的具有很强氧化活性的活性氧如O 2・-、H 2O 2、OH .等直接或间接地清除,防止了活性氧的级联放大作用,阻止和延缓了细胞膜系统的脂质过氧化作用及生物大分子如蛋白质和核酸的氧化损伤,保障了细胞内各种生命代谢活动的正常进行。因此,抗氧化酶系统在植物生命活动中起着举足轻重的作用。

但是,目前在国内外的研究文献中,不同的抗氧化酶有不同的提取和测定系统,显得纷繁复杂。而由于各抗氧化酶在清除活性氧时的协同作用,所以在研究中常需同时测定多种抗氧化酶,如果使用不同的酶提取系统,将使酶提取工作量加大而难以进行。此外,目前国内外有关抗氧化酶测

定的文献中绝大部分均未给出酶促反应的动力学变化情况。而酶促反应动力学的分析关系到酶活性的准确测定。在不同的反应时间内,酶促反应的速度不同,如果不同研究者采用的反应时间不同,所测得的酶活性大小也不一样。为了使抗氧化酶活性测定在一定程度上得到简化和统一,本文对五种抗氧化酶的提取系统和测定过程作了修改和完善,用单一提取系统来提取五种抗氧化酶,通过酶促反应的动力学分析,确定了五种抗氧化酶测定的适宜参数,使抗氧化酶的提取和测定比以前更加快速简便,而所得的测定结果有更好的准确性、重复性与可比性。

材料和方法

1植物材料的培养和处理

玉米种子(品种大黄)用0.1%HgCl 2消毒10min ,蒸馏水洗净后于26.5℃下吸涨12h ,然后转

入垫有6层湿润滤纸的白磁盘中,26.5℃下暗萌发60h 。选取长势一致的玉米幼苗转入150ml 0.1mmol/L H 2O 2溶液中或蒸馏水中(对照),处理4h 后再转入垫有6层湿润滤纸的白磁盘中恢复6h ,取中胚轴作下列酶分析。

　第22卷第6期2002年11月 云南师范大学学报Journal of Yunnan Normal University Vol.22No.6Nov.2002　

Ξ收稿日期:2002-05-09

0基金项目:国家自然科学基金、云南省自然科学基金及教育部优秀高校青年教师教学科研奖计划资助 作者简介:李忠光(1971-)男,云南省永德县人,实验师,主要研究方向为植物逆境生物学. 通讯作者:龚　明(Email :gongming @ )

2五种抗氧化酶的提取系统

在前人研究的基础上[5],我们对五种抗氧化酶的提取系统作了修改,得到下列的单一提取系统:50mmol/L Tris-HCl缓冲液,p H7.0,内含20%甘油,1mmol/L ED TA,1mmol/L ASA(抗坏血酸),1mmol/L D TT(二硫苏糖醇),1mmol/ L GSH(还原型谷胱甘肽),5mmol/L MgCl2。准确称取经上述处理的黄化玉米幼苗中胚轴(长约0.5cm)0.5g,加入预冷的提取液3ml和少许石英砂,充分冰浴研磨后,转入离心管中,再用2ml 提取液洗研钵,合并提取液并于4℃下20000×g 离心20min,将上清液分装,液氮冷冻后于-85℃保存或直接进行酶活性分析。

3酶活性的测定

3.1愈创木酚过氧化物酶(GPX,EC1.11.1.7)的测定。按照Chance和Maehly[6]的方法,并作如下修改:反应混合液为50mmol/L Tris-HCl缓冲液,p H7.0,内含0.1mmol/L ED TA,10mmol/ L愈创木酚,5mmol/L H2O2。测定时,反应混合液先在25℃水浴中预热。取反应混合液2.950 ml,立即加入酶液50μl以启动反应,终体积为3 ml,每隔30秒读出OD470的增加值。取0.5—3. 5min时间段,即3min反应时间来计算酶活性。

3.2过氧化氢酶(CA T,EC1.11.1.6)的测定。按照Aebi[7]的方法,并作如下修改:反应混合液为50mmol/L Tris-HCl缓冲液,p H7.0,内含0.1 mmol/L ED TA。测定时,反应混合液和750 mmol/L H2O2预先在25℃水浴中预热。取反应混合液2.900ml,加入酶液50μl,封口并于25℃下水浴中预热5min,到时加入750mmol/L H2O2 50μl(终浓度为12.5mmol/L)以启动反应,终体积为3ml,每隔30秒读出OD240的减少值。取0. 5—3.5min时间段,即3min反应时间来计算酶活性。

3.3超氧化物歧化酶(SOD,EC1.15.11)的测定。按照G iannopolitis和Ries[8]的方法,并作如下修改:反应混合液为50mmol/L Tris-HCl缓冲液, p H7.8,内含0.1mmol/L ED TA,0.1mmol/L NB T,13.37mmol/L蛋氨酸。测定时,反应混合液和0.1mmol/L核黄素溶液(用内含0.1mmol/ L ED TA的p H为7.8的50mmol/L Tris-HCl 缓冲液配制)预先于25℃水浴中预热。取反应混合液2.85ml(最大光还原管为2.90ml,不加酶液),加入酶液50μl,再加入核黄素溶液100μl,终体积为3ml,25℃下距离120瓦(30瓦/管)日光灯7cm(光强约1500lux)进行光化还原反应40min,到时用黑布蒙住,在无灯光照射的室内快速测定OD560。

NB T光化还原抑制曲线按照下列方法进行,取反应液2.900ml、2.900ml、2.895ml、2.890ml、2. 880ml、2.870ml、2.860ml、2.850ml、2.840ml、2.820ml、2.800ml、2.750ml、2.700ml,分别加入酶液0μl、0μl、5μl、10μl、20μl、30μl、40μl 、50μl、60μl、80μl、100μl、150μl、200μl和核黄素溶液100μl,终体积为3ml,用上述方法测定并作出NB T光化还原抑制曲线。

3.4抗坏血酸专一性过氧化物酶(APX,EC1.11.

1.7)的测定。按照Nakano和Asada[9]的方法,并作如下修改:反应混合液为50mmol/L Tris-HCl缓冲液,p H7.0,内含0.1mmol/L ED TA,0. 1mmol/L H2O2。测定时,反应混合液和30 mmol/L ASA预先在25℃水浴中预热。取反应混合液

2.900ml,加入酶液50μl,摇匀并调零,封口并于25℃下水浴中预热5min,到时加入30 mmol/L ASA50μl(终浓度为0.5mmol/L)以启动反应,终体积为3ml,每隔10秒读出OD290的减少值。取0—60秒时间段,即50秒反应时间来计算酶活性。

3.5谷胱甘肽还原酶(GR,EC1.6.

4.2)活性的测定。按照Halliwell和Foyer[10]的方法,并作如下修改:反应混合液为50mmol/L Tris-HCl缓冲液,p H7.5,内含0.1mmol/L ED TA,5mmol/L MgCl2。测定时,反应混合液、10mmol/L NADPH2和10mmol/L GSSG预先于25℃水浴中预热。取反应混合液780μl,加入酶液150μl、10mmol/L NADPH220μl(终浓度为0.2mmol/ L)及10mmol/L GSSG50μl(终浓度为0.5 mmol/L)以启动反应,终体积为1ml,每隔30秒读出OD340的减少值。取0.5—3.5min时间段,即3min反应时间来计算酶活性。

结果与讨论

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第6期 李忠光等:　在单一提取系统中同时测定五种植物抗氧化酶