黄酮的提取及抗氧化的测定

2.3、清除率测定：

本实验中抗氧化活性以清除DPPH自由基能力大小表示。当DPPH 溶液中加入自由基清除剂时，溶液颜色变浅，517nm 处的吸收光度变小。吸收度变小的程度与自由基被清除的程度呈线形关系，可用于检测自由基的清除程度，从而评价天然产物中活性物质的抗氧化能力。其能力用清除率来表示，按照下面公式计算清除率，清除率越大，抗氧化能力越强。根据以下公式计算样品的清除率：

清除率=〔1-（A

i -A

j

）/Ac〕 100%

（式中：A

i -----样品与DPPH溶液的吸收度；A

j

-----样品与70％乙醇的吸收度；

Ac------DPPH溶液与70％乙醇的吸收度）

黄酮类化合物的提取及其抗氧化性测定

实验原理

黄酮类化合物是一种良好的活性氧自由基清除剂。DPPH是一种稳定的自由基，其乙醇溶液呈紫色，在可见光区最大吸收峰为517nm。当DPPH溶液中加入自由基清除剂时，溶液颜色变浅，517nm处的吸收光度变小。吸收度变小的程度与自由基被清除的程度呈线形关系，可用于检测自由基的清除程度，从而评价天然产物中活性物质的抗氧化能力。其能力用抑制率来表示，抑制率越大，抗氧化能力越强。

实验仪器和主要试剂

1、组织捣碎机，分光光度计，电子分析天平，离心机，水浴振荡器

2、0.1mg/mL芦丁标液；

3、5%NaNO2；

4、10%Al(NO3)3；

5、1mol/LNaOH；无水乙醇；

6、二苯代苦味肼基自由基（DPPH，浓度为2 10¯4）；

操作步骤

1、芦丁标准曲线的绘制

精确称取0.1mg/mL芦丁标液0.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0mL于6个25mL 比色管中，用30%的乙醇补至10mL，加入1mL5%NaNO2，摇匀，放置6min，加入1mL10% Al（NO3）3，放置6min后，再加入10mL1moL/LNaOH，摇匀显色，定容，静置15min，以零管为空白，在510nm处测定系列吸光度。用最小二乘法做线形回归，求得芦丁浓度（Y）与吸光度（A）的关系曲线。

2、黄酮类化合物提取及含量测定

称取样品粉末1-2g，置于三角烧瓶中，向每个烧瓶中按1：20加入70%的乙醇溶液，摇匀。将三角烧瓶置于50℃的恒温水浴振荡器中，振荡提取45min；然后取出烧瓶，过滤提取液，同时提取液以4000r/min离心30min，离心后的清液定容至25ml，取2ml清液，稀释至25ml后，再取5ml清液于25ml比色管中，用30%的乙醇补至10mL，加入1mL5%NaNO2，摇匀，放置6min，加入1mL10%Al （NO3）3，放置6min后，再加入10mL1moL/LNaOH，摇匀显色，定容，静置15min，以零号管为空白，在510nm处测定吸光度。

3、抗氧化性测定

配制不同黄酮浓度的样品液。精确吸取样品溶液2.0mL，加入DPPH溶液2.0mL，摇匀，放置30min，以溶剂（70%乙醇）为空白，分别测定517nm处的吸光度Ai。同时，测定样品溶液2.0mL与乙醇2.0mL混合液517nm处的吸光度Aj。再测定DPPH溶液2.0mL与乙醇2.0mL混合液517nm处的吸收度Ac。平行测定3次，取平均值后根据以下公式（2）计算样品的抑制率。

五、计算

黄酮含量（%）=（Y 25 25 25/1 5 2 1000） 100% （1）式中：Y——黄酮浓度（mg/ml）

25——样液稀释后的体积（ml）

1——原料质量（g）

5，2——吸取的样液量（ml）

1000——换算系数

样品中提取出的黄酮化合物

黄酮得率（%）= ————————————————× 100% （2）

样品中的总黄酮含量

抑制率=〔1-（Ai-Aj）/Ac〕 100% （3）式中：Ai——样品液与DPPH溶液混合液的吸收度；

Aj——样品液与乙醇混合液的吸收度；

Ac——DPPH溶液与乙醇混合液的吸收度。

注意事项

1、DPPH溶液要现用现配。

2、比色前要先预热分光光度计，比色管应置于暗处。