一株拟除虫菊酯农药降解菌的分离鉴定及其降解特性与途径
酵母菌的分离筛选方法
酵母菌的分离筛选方法 酵母菌多数为腐生，一般生长在含糖较高，偏酸的环境中，在通气条 件下，液体培养比霉菌快。菌落与细菌相似，较大而厚，多数不透明， 菌落光滑湿润粘稠，乳白色，少数干皱，边缘整齐，呈红色或粉红色， 圆形椭圆卵形，液体培养基生长会生成沉淀或菌膜。 含高糖浓度（45%），分离蜂蜜酵母，球拟酵母属等嗜高渗透压的酵母。 1.培养基： 葡萄糖 50g/L 尿素1g/L （NH4）2SO41g/L L L MgSO41g/L FeSO4 L 酵母膏 L 孟加拉红 L （富集用） ★乳酸-马铃薯-葡萄糖培养基：马铃薯200g/L 葡萄糖（霉菌用蔗 糖）20g/L 乳酸5ml马铃薯去皮切片200g，加水煮沸30min，纱布 过滤，补足蒸馏水1L，PH自然。（去掉乳酸可用于酵母菌和霉菌培养 用）（富集用） ★麦芽汁培养基：1：4水60-65℃水浴3-4小时，4-6层纱布过 滤，可加一个蛋清加水20mL调均生泡沫，倒入糖化液中，煮沸过滤， 10-15波林，氯霉素L 121℃ 20min （分离保存 用） 灭菌后加入300u/ml硫酸链霉素（集菌用） ★虎红（孟加拉红）培养基：蛋白胨L 葡萄糖10g/L L L 孟加拉红L 氯霉素L 琼脂15g/L PH自然 （分离纯化用）
★豆芽汁培养基：黄豆芽100g/L 葡萄糖50g/L PH自然。100g黄豆芽，加水煮沸30min，纱布过滤，补足蒸馏水1L 察氏培养基：主要培养霉菌观察形态用 蔗糖30g/L 硝酸钠3g/L 磷酸氢二钾1g/L 氯化钾L 硫酸镁 L 硫酸亚铁L 琼脂15-20g/L 121℃ 20min PH自然 一般分离黄酒酵母酒精酵母使用曲汁培养基，啤酒酵母用酒花麦汁培养基，葡萄酒酵母用葡萄汁培养基。 2.集菌：研究酵母菌生态和某种基物或样品中的酵母菌区系，一般不进行集菌，以免改变其中不同种类数量间的对比，将样品制成菌悬液按常规法分离。若从样品中分离特定种类时先集菌。集菌发酵力强菌株，加酸性含糖的培养基，酸性豆汁，必要时注入高浓度的酒精（13-17%），霉菌在液体中形成菌丝体，酵母不形成菌丝，25-28℃2-3d，遇到菌丝体用接种环挑去烧掉，去掉上清液，取沉淀酵母一至两环移植另一液体培养基中，集菌连续两至三次才能完成，要配合镜检。 实例：将待分离的样品10g（ml）放入90ml无菌水或生理盐水/150ml 三角瓶（玻璃珠），摇床振荡20-30min，取上清液接种于酸性培养液（乳酸-马铃薯-葡萄糖培养基酸性麦芽汁或酸性豆芽汁）25-28℃2-3d，培养过程中若出现菌丝体跳出烧掉，集菌连续两至三次，培养液变成混浊，产生菌膜和沉淀物。镜检：美兰染液染色，活菌可还原美兰染液，菌体无色。 3.筛选：
酵母菌的分离纯化
酵母菌的分离纯化-CAL-FENGHAI-(2020YEAR-YICAI)_JINGBIAN
酵母菌的分离纯化、固定化和酒精发酵 第一部分酵母菌的分离纯化 一、实验目的 应用酵母菌的生理生化和生态学的特点，从自然环境中分离酵母菌，并掌握微生物分离纯化的基本方法。 二、实验原理 酵母菌常见于含糖份比较高的环境中，如果园土、菜园土及果皮等的表面。多数酵母菌喜欢偏酸条件，最适pH为酵母菌生长迅速，容易分离培养。在液体培养基中，酵母菌比霉菌生长快，利用酸性条件则可以抑制细菌的生长。因此常用酸性液体培养基获得酵母菌的加富培养，然后在固体培养基上划线分离纯化。 三、器材和用品 1、甘蔗、苹果皮、葡萄皮、果园土、菜园土等。 2、马铃薯葡萄糖琼脂培养基：马铃薯200g（煮开10min后过滤取汁），葡萄糖20g，琼脂20g，水1000ml，pH自然。分装三角瓶；试管斜面1支/组 3、乳酸马铃薯葡萄糖培养液：配方同上，不加琼脂加乳酸，按1000ml培养基加入5ml乳酸，pH为左右，再分装试管9ml2支/组。 4、无菌吸管3支/组、无菌培养皿、100ml无菌水1瓶/组、涂棒、美兰染液、显微镜、接种环等。 四、实验方法 1、接种：取果皮（不需冲洗）或土壤5克，加入到100ml无菌水中，充分搅拌后，用无菌吸管取1ml接入到9ml乳酸马铃薯葡萄糖培养液中，在28-30℃培养箱中培养24h，可见培养液变浑浊。 2、加富培养：用无菌吸管取上述培养液1m l，注入另1管乳酸马铃薯葡萄糖培养液中，在28-30℃培养箱中培养24h。 3、镜检：用无菌操作法用接种环取少量菌液置于载玻片上，中央滴一滴美兰染液，混合均匀后制成水浸片，在高倍镜下观察酵母菌的形态及出芽方式，并可根据菌体是否染色来区分酵母菌的死活细胞，因活细胞使美兰染液还原，故菌体不着色。 4、涂皿：用马铃薯葡萄糖琼脂培养基溶化后制成平板，用无菌吸管取加富培养液到平板中，用涂棒涂匀后培养24h。 5、分离纯化：用接种环挑取单个酵母菌菌落，在平板上四区划线，培养后分
生物化学实验五 酵母核糖核酸的分离及组分鉴定
实验五酵母核糖核酸的分离及组分鉴定 一、目的要求 学习和掌握稀碱法提取酵母RNA的原理和方法；了解核酸的组分，并掌握鉴定核酸组分的方法。 二、实验原理 酵母核酸中RNA含量较多。RNA可溶于碱性溶液，在碱提取液中加入酸性乙醇溶液可以使解聚的核糖核酸沉淀，由此即得到RNA的粗制品。 核糖核酸含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸各组分。加硫酸煮沸可使其水解，从水解液中可以测出上述组分的存在。 三、器材与试剂 1〉材料 酵母粉。 2〉器材 乳钵、150ml锥形瓶、水浴锅、量筒、吸管、洗耳球、漏斗、滴管、试管、试管架、烧杯、离心机、滤纸、试管夹。 3〉试剂 (1) 0.04mol/L氢氧化钠溶液。 (2)酸性乙醇溶液：将0.3ml浓盐酸加入30ml的乙醇中。 (3)95%乙醇。 (4)乙醚。 (5)
1.5mol/L硫酸溶液。 (6)浓氨水。 (7) 0.1mol/L硝酸银溶液。 (8)三氧化铁-浓盐酸溶液： 将2ml 10%三氧化铁溶液(用FeCl 3·6H 2O配制)加入到400ml浓盐酸中。 (9)苔黑酚乙醇溶液： 溶解6g苔黑酚于100ml 95%乙醇中。 (10)定磷试剂。 a.17%硫酸溶液： 将17ml浓硫酸(比重 1.84)缓缓加入到83ml水中。 b. 2.5%钼酸铵溶液：将2.5g钼酸铵溶于100ml水中。 c.10%抗坏血酸： 将10g抗坏血酸溶于100ml水中，储于棕色瓶保存。溶液呈淡黄色时可用，如呈深黄色或棕色则失效。 临用时将上述3种溶液与水按比例混合：17%硫酸溶液︰ 2.5%钼酸铵溶液︰10%抗坏血酸︰水=1︰1︰1︰2(体积分数)。
四、实验步骤 1〉RNA提取 将10g酵母悬浮于90ml 0.04mol/L氢氧化钠溶液中，并在乳钵中研磨均匀。将悬浮液转移至150ml 锥形瓶中。在沸水浴上加热30min后，冷却。(3000r/min)离心10分钟，将上清液缓缓倾入30ml酸性乙醇溶液中。注意要一边搅拌一边缓缓倾入。待核糖核酸沉淀完全后，(3000r/min)离心5分钟。弃去上清液。用95％乙醇洗涤沉淀两次，每次10ml。乙醚洗涤沉淀一次后，再用乙醚将沉淀转移至漏斗中过滤。沉淀即为粗RNA，可在空气中干燥。作鉴定或测定含量用。 2〉鉴定 取200mg提取的RNA，加入 1.5mol/L硫酸溶液10ml，在沸水浴中加热10min制成水解液并进行组分的鉴定。 (1)嘌呤碱： 取水解液1ml加入过量浓氨水，然后加入约1mL 0.1mol/L硝酸银溶液，观察有无嘌呤碱的银化合物沉淀。 (2)核糖： 取一支试管加入水解液1mL、三氯化铁浓盐酸溶液2ml和苔黑酚乙醇溶液 0.2ml。放沸水浴中10分钟。注意溶液是否变成绿色，说明核糖的存在。 (3)磷酸： 取一支试管，加入水解液1ml和定磷试剂1ml。在沸水浴中加热10min，观察若溶液变成蓝色，说明有磷酸存在。 五、结果处理
微生物降解有机磷农药酶促机制
1微生物降解有机磷农药 有机磷农药（organophosphorus pesticides，OPs）是农药中很重要的一类，具有高效的杀虫能力，为增加粮食生产、防治疾病传播作出了巨大贡献。但是，有机磷农药的生产、运输和大量使用对生态环境中其他非靶标生物乃至土壤、水、大气整个生态系统产生的负面影响日益严重，尤其是果蔬等农产品中的农药残留通过食物链在生物体内富集对人类造成严重危害更不容忽视。 有机磷农药污染降解技术可分为热降解、光降解、化学降解和生物降解。生物降解（biodegra-dation）是通过生物的作用将农药分解为无毒或低毒小分子化合物，并最终降解为水、CO2和矿物质的过程。相对于物理、化学降解技术，生物降解具有高效、彻底、无二次污染的优势，20世纪40年代后已经成为研究热点。作物本身、微生物都能够降解有机磷农药残留，但植物的降解很缓慢，周期很长，微生物由于其强大的代谢多样性，在有机磷农药残留降解中具有更大的优势。 2有机磷农药降解酶 微生物对于农药的降解可分为酶促和非酶促反应。所谓酶促反应是指微生物以胞内酶或分泌的胞外酶直接作用于农药，经过一系列生理生化反应，最终将农药完全降解或分解成分子量较小的无毒或毒性较小的化合物的过程。而非酶促形式指的是微生物通过代谢改变农药的环境离子浓度、pH等物理、化学性质，从而间接促使降解农药的过程。酶促反应是微生物降解农药的主要形式，微生物本身含降解农药的酶系基因，或本身虽无该酶系基因，但是经诱导或环境存在选择压，基因发生重组或改变产生了新的降解酶系。 20世纪80年代，Munnecke等发现有机磷农药降解酶比产生这类酶的微生物菌体更能忍受异常环境条件，如来源于假单胞菌的降解酶在10%的无机盐、1%的有机溶剂、50℃下都能保持高活性，而该酶的产生菌在同样的条件下却不能生长，而且，酶的降解效果远远胜于微生物本身，特别是对低浓度的农药更有效。因此，人们的思路从应用微生物菌体净化农药污染转向利用有机磷农药降解酶。因此，有机磷农药降解酶目前已被公认为是消除农药残留的最有潜力的新方法。常见的有机磷农药降解酶（Organophosphorus hydrolase）主要是水解酶类，包括磷酸酶、对硫磷水解酶、酯酶、硫基酰胺酶、裂解酶等，它们主要通过裂解P－O键、C－P 键、P－S键降解有机磷农药。由于各种有机磷农药都有类似的结构，只是取代基不同，所以一种有机磷农药降解酶往往可降解多种有机磷农药。 第1个有机磷农药降解酶是1974年Munneck 等［1］从假单胞杆菌中检测出磷酸酯酶的活性，发现其对对硫磷具有降解作用，同时对甲基对硫磷、二嗪农、毒死蜱等7种有机磷农药均能有效降解，在22℃时降解效率比化学降解快1000~ 2450倍，且该酶不为农药及农药制剂中溶剂所抑制，对环境条件有较宽的忍受范围。1979年，Brown等就对来源于黄杆菌(ATCC27551)的有机磷农药降解酶进行了部分纯化并对酶的性质进行了初步研究，发现酶反应的最适pH范围为8~10；酶的活性不受金属离子的影响，被非离子去污剂抑制。1989年，Mulbry等从3株革兰氏阴性菌中提取到3个对硫磷水解酶，分别测定了分子量，并对酶学性质做了研究。这3个酶分子量不同，对不同底物的作用也不同。同年，Dumas等纯化得到来源 微生物降解有机磷农药酶促机制 刘建利（北方民族大学生物科学与工程学院宁夏银川750021） 摘要有机磷农药污染严重，微生物有机磷农药是治理有机磷农药残留的新技术，综述有机磷农药降解酶的研究现状、酶促作用机理、基因工程等方面的研究现状。 关键词有机磷农药酶促机制 中国图书分类号：X172文献标识码：A *基金项目：宁夏自然科学基金（NZ0690）
传统酸面团中细菌与酵母菌的分离与鉴定
传统酸面团中细菌与酵母菌的分离与鉴定 刘同杰1，李云1，吴诗榕1，金乐天1，2，张国华1，杨浣漪1，何国庆1 （1.浙江大学生物系统工程与食品科学学院，浙江省食品微生物技术重点实验室，浙江大学馥莉食品研究院，浙江杭州 310058）（2.朝鲜韩德秀平壤轻工业大学，朝鲜平壤） 摘要：为进一步描述我国传统面食发酵剂的理化性质和菌落组成，收集了北方地区6份发酵剂样品，测定了其酸度和菌落总数，并对分离、纯化、初筛后得到的75株细菌和60株酵母菌进行了测序鉴定。结果显示，样品pH值范围为3.73~5.46，总滴定酸度为8.3~19.8 mL；乳酸菌和酵母菌的计数结果分别为8.35±0.07~9.75±0.12 Log cfu/g，6.31±0.22~8.68±0.04 Log cfu/g。鉴定出包括短乳杆菌 （Lactobacillus brevis）、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）和旧金山乳杆菌（Lactobacillus sanfranciscensis）在内的乳酸菌8种；酵母菌4种，其中优势菌为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）；其他细菌6种，主要为解淀粉芽孢杆菌（B. amyloliquefaciens）、地衣芽孢杆菌（B. licheniformis）和醋杆菌。结果表明，我国传统面食发酵剂菌相复杂，以酵母菌和乳酸菌为主，还包括芽孢杆菌、醋酸杆菌在内的多种其他细菌，甚至可能含有致病菌。通过比较细菌和酵母在不同酸面团样品中的分布，发现不同来源样品的微生物种类组成存在差异。 关键词：酸面团；菌相分析；16S/26S rDNA测序；生物多样性；系统发育树 文章篇号：1673-9078(2014)9-114-120 DOI: 10.13982/j.mfst.1673-9078.2014.09.020 Isolation and Identification of Bacteria and Yeast from Chinese T raditional Sourdough LIU T ong-jie1, LI Yun1, WU Shi-rong1, JIN Le-tian1,2, ZHANG Guo-hua1, YANG Huan-yi1, HE Guo-qing1 (1.College of Biosystems Engineering and Food Science of Zhejiang University, Zhejiang provincial key laboratory of Food Microbiology, Fuli Institute of Food Science of Zhejiang University, Hangzhou 310058, China) (2.DPRK Han Dexiu Pyongyang University of light industry, Pyongyang, DPRK) Abstract: In this study, the physicochemical properties and microbial profile of traditionally fermented sourdough for Chinese steamed bread were examined. Six samples of sourdough were collected from northern China. Acidity and colony counts were measured. After isolation, purification, and preliminary screening, 75 strains of bacteria and 60 strains of yeasts were obtained and identified by DNA sequencing. The pH was between 3.73 and 5.46 and total titratable acid (TTA) values ranged from 8.3 to 19.8 mL. In all the samples, the number oflactic acid bacteria (LAB) and yeasts ranged from 8.35±0.07 to 9.75±0.12 Log cfu/g and 6.31±0.22 to 8.68±0.04 Log cfu/g, respectively. Eight LAB species, including Lactobacillus brevis, L. plantarum, and L. sanfranciscensis, and six other bacterial species, including Bacillusamyloliquefaciens, Bacilluslicheniformis, and three species of Acetobacter, were identified. Among the four identified yeasts, the dominant species was Saccharomyces cerevisiae. The results indicate that Chinese traditional starter cultures for flour-based food are complex bacterial floras dominated by LAB and yeast, in addition to several other microorganisms, including Bacillus spp., Acetobacter spp., and even pathogenic bacteria. Differences in microbial species compositions among LAB and yeasts in samples from different areas were identified by comparing species distributions in different sourdough samples. Key words: sourdough; elucidation of microbial flora structure; 16S/26S rDNA sequencing; biodiversity; phylogenetic tree 我国传统的面食发酵剂类似于西方发酵面包用的酸面团，在我国一般被称为“老面”、“酵子”、“面收稿日期：2014-04-17 基金项目：国家自然科学基金资助项目（31371826） 作者简介：刘同杰（1989-），男，在读博士，研究方向：传统发酵食品通讯作者：何国庆（1957-），男，博士，教授，研究方向：食品生物技术及发酵工程肥”等[1]，具有悠久的使用历史。上世纪80年代，即发活性干酵母被引入我国，因其使用便捷，传统面食发酵剂逐渐被取代，但直到现在仍有很多地区尤其农村地区，仍然使用其制备馒头等主食，因使用传统面食发酵剂制备的馒头品质更优。究其原因，活性干酵母为单一菌种发酵，与传统发酵剂的混菌体系发酵相比，发酵的馒头风味平淡、香气不佳，总体的感官品 114
实验 酵母RNA的分离及组分鉴定
※实验六酵母RNA的分离及组分鉴定 【实验目的】 了解核酸的组分，并掌握鉴定核酸组分的方法。 【实验原理】 酵母核酸种RNA含量较多。RNA可溶于碱性溶液，在碱提取液中加入酸性乙醇溶液可以使解聚的核糖核酸沉淀。由此即得到RNA的粗制品。 核糖核酸含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸各组分。加硫酸煮沸可使其水解，从水解液中可以测出上述组分的存在。 鉴定依据：磷酸与定磷试剂反应产生蓝色物质。核糖与苔黑酚作用产生绿色物质。嘌呤碱与硝酸银能产生白色的嘌呤碱银化合物沉淀。 【实验器材】 150 ml锥形瓶、水浴、量筒、漏斗及抽虑瓶、吸管7、滴管8、试管及试管架9、烧杯、离心机、漏斗 【试剂和材料】 1、0.04 mol/L氢氧化钠溶液； 2、酸性乙醇溶液：将0.3毫升浓盐酸加入30毫升乙醇中； 3、95%乙醇； 4、乙醚； 5、1.5 mol/L硫酸溶液； 6、浓氨水； 7、0.1 mol/L硝酸银溶液； 8、三氯化铁浓盐酸溶液：将2 ml 10% 三氯化铁溶液（用FeCl3·6H2O配制）加入到400 ml浓盐酸中； 9、苔黑酚（地衣酚）乙醇溶液：溶解6 g苔黑酚于100 ml 95% 乙醇中（可在冰箱中保存一个月）； 10、定磷试剂：（1）17% 硫酸溶液：将19 ml浓硫酸（比重1.84）缓缓加入到83 ml 水中（2）2.5% 钼酸铵溶液：将2.5 g钼酸铵溶于100 ml水中（3）10% 抗坏血酸溶液：10 g抗坏血酸溶于100 ml水中，贮棕色瓶保存（溶液呈淡黄色时可用，如呈深黄或棕色则失败，需纯化抗坏血酸）。临用时将上述3种溶液与水按如下比例混合。17% 硫酸溶液：2.5%
有机磷农药的微生物降解研究进展
有机磷农药的微生物降解研究进展 摘要：有机磷农药的广泛和大量使用给环境带来了越来越多的危害，作为有机 磷农药的主要降解方式之一，微生物降解发挥着重要的作用。从有机磷农药降解微生物的种类、降解机理和途径、影响微生物降解有机磷农药的因子、微生物降解有机磷农药的途径,并探讨有机磷农药微生物降解的发展趋势和研究展望。 关键词：微生物降解有机磷农药研究展望 前言：农药是确定农业稳定,丰产或者不缺产的重要生产资料。但农药一方面 残留在农产品中,对人体有害?另一方面,在环境中不断积累,带来了日益严重的环境与生态问题。农药的负面效应很多,但总体来说仍是功大于过,而且在未来农业可持续发展战略中,农药将继续挥作用。因此现在摆在我们面前的问题是如何尽可能降低农药的负面效应【1】。有机磷农药的降解主要有生物降解、光化学降解、化学降解等方式,其中生物降解的作用占重要地位。生物降解特别是微生物降解被认为是一种有效的措施,利用微生物或微生物产品来降解污染物的生物修复方法具有无毒、无残留、无二次污染等优点,是消除和解毒高浓度的农药残留的一种安全、有效、廉价的方法。自20世纪60年代有机氯农药在世界范围内受到限制，随之是有机磷农药的发展，到目前有机磷农药已成为应用广泛、品种最多的农药。有机磷农药容易降解，对环境的污染及对生态系统的危害和残留没有有机氯农药那么普遍和突出，且具有药效高、品种多、防治范围广、成本低、选择作高、药害小、在环境中降解快、残毒低等优点。它的降解一直是国内外学者研究的热门方向。 1、有机磷农药的生产和使用现状 随着科技的发展和进步，对农药的需求在一定程度上有所减少，但有机磷等农药在农业上的生产与应用仍占据重要地位。目前,包括杀虫剂、除草剂、杀菌剂在内，世界上的有机磷农药已达150 多种，中国使用的有机磷农药有30 余种。按照毒性大小常分为 3 大类：1.剧毒类，如甲拌磷、内吸对硫磷、保棉丰、氧化乐果等；2.高毒类，如甲基对硫磷、二甲硫吸磷、敌敌畏、亚胺磷等；3.低毒类，如敌百虫、乐果、氯硫磷、乙基稻丰散等。一些有机磷杀虫剂如甲胺磷、对硫磷、久效磷等剧毒杀虫剂在国际上已是禁用产品或限制的品种【2】。 2、有机磷降解微生物的种类 目前，人们已分离出多种能降解有机磷农药的微生物菌群，其中包括细菌、放线菌、真菌和一些藻类。由于细菌具有生化多适应性及易诱发突变菌株等优势，故其在微生物降解中占有重要地位【3】。至今，已分离到的细菌主要有：假单胞菌属（Pseu－domonas）、芽孢杆菌属（Baccillus）、黄杆菌属（Flavobacterium）、不动杆菌属（Acinetobacter）、节杆菌属（Arthrobacter sp.）、沙雷氏菌属（Serratia sp.）等。金彬明等从被有机磷污染的海水样中分离筛选出一株蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）菌株，在28℃下对甲胺磷（5 mg/L）的降解率达48.9％。解秀平等从污水曝气池中分离得到一株能以甲基对硫磷及其降解中间产物对硝基苯酚为唯一碳源的节杆菌属（Arthrobacter sp.）菌株，在 5 h 内对50 mg/L 的
酵母菌的分离与纯化
酵母菌的分离与纯化 小组组员: 一、实验目的 1.学习分离纯化酵母菌的技术与方法 2.了解培养基的配置与灭菌技术 3.增强无菌操作技术的意识 二、基本原理 从混杂的微生物群体获得只含某一种某一株微生物的过程叫做微生物分离与纯化，酵母菌常见于含糖份比较高的环境中，如果园土、菜园土及果皮等的表面。多数酵母菌喜欢偏酸条件，最适pH为4.5-6.0.酵母菌生长迅速，容易分离培养。马丁氏培养基是一种用来分离真菌的选择性培养基。此培养基是由葡萄糖、蛋白胨、KH2PO4、MgSO4·7H2O、孟加拉红(玫瑰红，Rose Bengal)和链霉素等组成。其中葡萄糖主要作为碳源，蛋白胨主要作为氮源，KH2PO4和MgSO4·7H2O作为无机盐，为微生物提供钾、磷和镁离子。而孟加拉红和链霉素主要是细菌和放线菌的抑制剂，对真菌无抑制作用，因而真菌在这种培养基上可以得到优势生长，从而达到分离真菌的目的。 三、实验材料及用具 1.用品：苹果、葡萄糖、琼脂、水、1%孟加拉红水溶液、马铃薯 2.设备与器材：1ml的无菌吸管、无菌培养皿等. 四、实验步骤 1、马铃薯培养基的配置 培养基成分:马铃薯 40克、蔗糖（葡萄糖） 4克、琼脂 4克、水 200毫升、 pH 自然。配置方法: （1）配制20%马铃薯浸汁：取去皮马钓薯40g，切成小块，加水200ml.加热煮游30 min ，用纱布过滤，然后补足失水互所需体积。121Pa灭菌30min.即成20%马铃馨漫汁，贮存备用。 （2）配制时，按每100ml 马铃薯浸汁加入2g蔗糖，加热煮沸后加入4克琼脂，继续加热融化并补足失水。 （3）分装、加塞，包扎。 （4）高压蒸汽灭菌：121Pa灭菌30min
酵母菌的分离与纯化
酵母菌的分离与纯化 土壤是微生物生活的大本营，是寻早有重要应用潜力的微生物的主要菌源。不同图样中各类微生物的含量不同，一般土壤中细菌数量最多，其次为放线菌和霉菌。放线菌一般在较干燥、偏碱性、有机质较多的土壤中较多；霉菌在含有机质丰富、偏酸性、通气性较好的土壤中较多；酵母菌在一般土壤中的数量较少，而在酒曲、面肥、水果表皮、果园土壤中数量多些。（一）菌源 1土样用无菌的采样小铲在橘树果园中取土壤表层下1~10cm土壤10g，装入灭菌的牛皮纸袋内。封好袋口，记录取样地点、环境及日期。图样采集后应及时分离，饭不能立即分离的样品，应保存在低温、干燥的条件下，以减少其中菌相的变化。 2面肥 （1）面粉500克，白酒100克，水250，和好静置发酵就可以了。冬季10个小时。（2）在温水中兑一点酒，倒入适量面粉拌匀后放入绝缘保温盛器（陶瓷，砂锅）中，用布将整个盛器盖好置于温度较高处，6小时后即成面肥。 *以上方法做出的面肥只能保存几天，不宜放置太久。 3水果果皮 桔子和葡萄等的果皮上含有数量较多的酵母菌，既可单独作为菌源也可以和果园土壤作为混合菌源。 （二）酵母菌的分离 1制备菌悬液 称取菌源1g，加入盛有99ml无菌水或无菌生理盐水并装有玻璃珠的锥形瓶中。振荡20min，即成10-2的菌源悬液。再一次稀释成10-4、10-5、10-6三个稀释度。 2涂布法分离 取融化并冷却至45~50度左右的豆芽汁葡萄糖培养基，每皿分别倾注约12ml培养基到培养皿内。注意，温度过高易将菌烫死，皿盖上冷凝水太多也会影响分离效果；低于45度培养基易凝固，平板高低不平。呆平板冷却后，用无菌移液管分别吸取上述已经制好的菌源稀释液10-4、10-5、10-6三个稀释度菌悬液各0.1ml，依次滴加于相应编号的豆芽汁葡萄糖培养基平板上。每个稀释度做2~3个平行皿。左手拿培养皿，并用拇指将皿盖打开一缝，再火焰旁右手持无菌玻璃涂棒将菌液自平板中央均匀向四周涂布扩散。注意，切忌用力过猛，这样会将菌液直接推向平板边缘或将培养基划破。3培养 接种后，平版倒置于30度恒温箱中，培养2~3天，观察结果。 4纯化 用接种环挑取单个单个酵母菌菌落，在平板上四区划线，培养后分离得到单个菌落。 酵母扩培方案 一、培养基制备 (一)麦芽汁培养基的配制 1．培养基成分 新鲜麦芽汁一般为10-15波林。 2．配制方法 (1)用水将大麦或小麦洗净，用水浸泡6-12h，置于15℃阴凉处发芽，上盖纱布，每日早、中、晚淋水一次，待麦芽伸长至麦粒的两倍时，让其停止发芽，晒干或烘干，研磨成麦芽粉，贮存备用。 (2)取一份麦芽粉加四份水，在65℃水浴锅中保温3-4h，使其自行糖化，直
酵母菌的分离鉴定、固定化及酒精发酵3(DOC)
酵母菌的分离鉴定、固定化及酒精发酵 吴英玲 10197020 10生物创新班 摘要：酵母菌喜欢酸性环境，可利用乳酸豆芽葡萄糖培养基富集培养酵母菌，然后在YPG培养基上用划线法分离纯化出酵母菌。将分离的酵母菌转接于YPG斜面培养基上培养，待长好后置于冰箱内 4 ℃下保存。用TTC显色剂及杜氏小管观察法筛选出发酵能力高的酵母菌。并通过菌落形态、细胞形态、生化分析及分子生物学手段进行微生物鉴定。采用PVA-海藻酸钠固定化技术固定酵母细胞进行酒精发酵。 关键词：酵母菌分离鉴定固定化酒精发酵 Abstract: Yeast like acid environment, the use of lactic acid glucose medium enrichment culture yeast, bean sprouts and purification by marking method on the YPG culture medium of yeast will transfer separation of the yeast in the YPG cant medium cultivation, staying long placed in the refrigerator after use the TTC chromogenic agent, save and duchenne tubular observation screen high fermentation ability by colony morphology of yeast cell morphological and biochemical analysis and molecular biology means to identify the microorganisms using PVA - sodium alginate immobilized technology fixed yeast cells for ethanol fermentation。 前言 酵母菌（yeast）是一类单细胞真菌。一般呈圆形、卵圆形、圆柱形，其菌落呈乳白色或红色，表面湿润、粘稠，易被挑起。酵母菌多数为腐生，专性或兼性好氧，广泛生长在偏酸性的潮湿的含糖环境中，例如水果、蔬菜、蜜饯的内部和表面以及在果园土壤中最为常见。酵母菌在有氧环境下将葡萄糖转化为水和二氧化碳，主要用于馒头、面包等食品发酵；在工业上，酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）将葡萄糖、果糖、甘露糖等单糖吸
酵母菌的分离纯化实验方案
酵母菌的分离纯化 ?实验目的 1.了解培养基的配置与灭菌技术； 2.无菌操作技术； 3.工业微生物的分离与纯化技术； 4.工业微生物的检测及保藏。 ?基本原理 1、培养基是人工配置的用于培养、分离、鉴定和保存各种微生物的营养基质。也适合微生物在生命活动中积累各种代谢产物。由于微生物种类不同，营养类型各异以及实验目的不同，因此培养基的种类也很多。不同微生物对营养的要求不同，在配置时根据微生物对PH 的要求选择合适的PH。由于本次实验主要是分离纯化酵母菌，所以配置的培养基是适合酵母菌生长麦芽汁平板培养基，同时添加抗生素抑制霉菌及其它菌的生长。 2、接种和培养过程中必须保证不被其它微生物所污染，关键在于严格进行正确的无菌操作，但是绝对无菌是不可能的，只能人工创造相对无菌的环境。所以本次实验无菌操作是在超净工作台的酒精灯火焰旁进行。 3、把特定微生物从混杂的微生物群体中分离出来而获得某一种或某一株微生物的过程叫微生物的分离与纯化。首先根据其生长特性设计只利于此菌生长的条件，再根据各种稀释法使他们在固体培养基上单独长成菌落。分离纯化的方法通常有：稀释混合倒平板法、稀释涂布平板法和平板划线。此次实验采用梯度稀释涂布平板法。 4、微生物检测项目最常用的是细胞数的检测，方法比较多，主要有显微镜直接计数法、平板菌落计数法（CFU）、光电比浊计数法等。本次实验设计酵母菌的数量检测，选用显微镜直接计数法和平板菌落计数法。 实验器材 仪器设备 恒温水浴锅、电热干燥箱、蒸汽灭菌锅、超净工作台、恒温培养箱、恒温摇床、水浴锅、电炉、铜锅、酒精灯、接种环、电子天平、研钵、光学显微镜、血细胞计数器 玻璃器皿 烧杯、锥形瓶、大小试管、培养皿、漏斗、三角涂棒、吸管、试管架、玻璃涂棒、盖玻片 试剂与材料 苹果、大麦芽、琼脂、蒸馏水、碘液、抗生素、染色液 其它 纱布、滤纸 ?实验内容及操作步骤 (一)、样品的选择 酵母菌一般在果园的土壤中或者水果的表面含量较多，因此选择苹果为样品。 （二）、样品的处理 制备苹果悬液 1.首先将1g苹果在研钵中磨细，放入装有10ml生理盐水和玻璃珠的100ml三角瓶中去。
氯氰菊酯降解菌的分离鉴定及其降解特性研究(一)
氯氰菊酯降解菌的分离鉴定及其降解特性研究(一) 【摘要】目的分离得到能高效降解氯氰菊酯的菌株。方法采用选择性培养基从农药厂的污泥中进行富集和分离筛选高效菌株，并且用16SrDNA序列分析法和其生理生化特征对其进行鉴定。结果该菌株鉴定为克雷伯氏菌属(Klebsiellasp.)，命名为（登录号为AY989899），菌株能以氯氰菊酯为唯一碳源进行生长，降解氯氰菊酯的最适温度是35℃,最佳pH是7.0。结论菌株是一株能高效降解氯氰菊酯的菌株。 【关键词】氯氰菊酯；克雷伯氏菌；生物降解 gradingstrainfromthesamplesandidentifyingthestrainbyusingthe16SrDNAsequenceanalysisanditst growwithcypermethrinassolesourceofcarbon.TheoptimaltemperatureandpHofcypermethrindegra dationbytheorganismwere35℃and7.0.Conclusion methrin. Keywords:cypermethrin；；biodegradation 随着20世纪80年代无机盐农药和有机氯农药的相继禁用，菊酯类农药已发展为我国现阶段使用最广泛的农药之一，由于具有广谱、内吸、触杀等高效杀虫特性，因此广受农业生产者欢迎。但是，大量使用引起的农药残留不仅造成环境与食品的污染，而且影响农产品的质量及人们的身体健康。农药残留及其废水的降解主要有微生物降解、化学降解和光降解等方式。与其他的降解方式相比，微生物降解具有操作简单、降解彻底、无二次污染等优点。因此利用微生物技术处理农药残留，并对受污染的土壤与水体进行生物修复是一种行之有效的方法。目前对有机磷和有机氯等农药的微生物降解的研究比较多，而关于菊酯类农药的降解研究较少。本文从农药厂的污泥中采集土壤样品，筛选分离到一株能高效降解氯氰菊酯的菌株（），并对其进行筛选、鉴定及降解性能的初步研究〔〕。 1材料与方法 1.1培养基 富集培养基（1L）：蛋白胨10g、NaCl2.0g、KH2PO41.5g、葡萄糖1.0g、dH2O1000mL，pH值7.0；经115℃，灭菌20min。基本培养基（1L）：NH4Cl1.0g，KH2PO40.5g，K2HPO41.5g，MgSO40.2g，NaCl0.5g，加入氯氰菊酯作为唯一碳源，浓度视需要添加。LB液体培养基（1L）：蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl5g，pH值7.0（固体加2%的琼脂粉）。 1.2实验试剂 氯氰菊酯（质量分数95%）原药和标准品（质量分数99.9%，色谱纯）购自成都化学试剂公司；TaqDNA聚合酶与各种限制性内切酶均购自大连宝生物；3SDNAGelPurificationkitV3.1购自上海申能博彩生物科技有限公司；PCR引物由上海博亚合成；载体试剂盒购自大连宝生物。 1.3降解菌株的富集和分离 将采集的农药污染土样配制成15%的悬浮液，以5%的接种量接到含25mg/L氯氰菊酯的富集培养基中，并加适量玻璃珠，37℃、160r/min振荡培养。待菌长出后，取1mL菌液接入同样培养基中37℃培养，传代过程中氯氰菊酯的浓度逐步增高至300mg/L,大约2d传代1次。将富集的农药降解菌菌液用无菌水作10倍梯度（10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6）稀释，分别取0.2mL悬液涂布在含有50mg/L氯氰菊酯的无机盐固体培养基上，37℃培养；当平板出现菌落时，将单菌落在无机盐农药平板上划线分离、纯化菌株。将生长快、菌落规则、传代稳定的单菌落斜面保存。将初筛纯化的斜面单菌落接入含有50mg/L氯氰菊酯的无机盐液体培养基,37℃、160r/min培养2d，测定其降解率。
有机磷农药的残留危害及其微生物降解
环境与健康期末论文 教师：蔡兰坤 学院：资源与环境学院学号：B2014009 班级：环境122 姓名：严义昌
有机磷农药的残留危害及其微生物降解 严义昌资环学院环境122学号：B2014009 （华东理工大学资源与环境学院，上海201424） 摘要：有机磷农药因为自身的优良特性开始逐步取代对环境危害更大的有机氯农药，它的大量使用在提高了作物产量的同时也对动物和人体产生了许多负面效应，造成了全球性的环境污染和生态破坏.而有机磷农药残留问题已经直接威胁到人类的生存和可持续发展.微生物因为众多的种类和新城代谢的多样性在有机磷农药降解中表现出独特的优势.对降解有机磷农药的微生物种类，有机磷降解菌的获得和鉴定，有机磷的降解机理，有机磷农药降解菌的广谱性和目前存在的问题以及未来的研究方向做出论述. 关键词：有机磷农药；微生物降解；降解机理；降解菌广谱性 20世纪60年代以来，由于有机氯农药难以被动植物降解而且在生物体内降解速度慢，致使许多国家开始限制和禁止使用有机氯农药.有机磷农药作为有机氯农药的替代品，因为具有品种多，成本低，药效好，应用范围广，对自然环境的污染以及对生态系统的危害和残留没有有机氯农药那么普遍和突出等优点迅速发展起来，从20世纪70年代起，有机磷杀虫剂的使用量逐年上升.正是因为有机磷农药在我国大量、频繁和反复地使用，导致其过量残留.残存于作物、土壤或水体中的有机磷农药，经物理迁移或化学转化，最终通过食物链的传递和富集作用影响人类及其他有益生物体[1].世界上有机磷农药种类超过150种，中国生产和使用的有机磷农药有将近40种，其中常用的有敌百虫、乐果、敌敌畏、马拉硫磷、对硫磷、辛硫磷等.有机磷农药的结构区别很大，毒性也大不一样，其中对硫磷类农药的毒性最大. 1有机磷农药的毒性效应 有机磷农药引起的中毒主要为急性中毒，以神经症状为主.轻度中毒时表现为头痛、头晕、恶心、呕吐、疲倦、食欲不振等症状，血液胆碱酯酶活力下降到70%-50%；中度中毒时除上述症状加重外，还会出现肌肉震颤、瞳孔缩小、胸闷、轻度呼吸困难、流涎、流汗、腹痛、腹泻、血压和体温升高等症状，血液胆碱酯酶活力下降到50%-30%；重度中毒除上述症状和特征外，并伴有心率加快、血压升高、瞳孔高度缩小、肌肉震颤明显、呼吸困难、昏迷、循环衰竭等，少数人出现脑水肿，血液胆碱酯酶活力下降到30%以下.同时研究表明有机磷农药具有遗传毒性，可导致基因内部DNA的改变，并引起一定的表型变化. 除了急性毒性外，也发现了有机磷农药的慢性毒性作用，不过其慢性中毒症状无明确的特异性，仅以神经衰弱综合征为主，如头痛、头晕、食欲不振、记忆力减退等. 有机磷农药作为潜在的化学致癌物还可能参与癌症的发生.经流行病学调查发现，非霍奇金淋巴瘤（NHL）、白血病、前列腺癌的发生同接触有机磷农药混合物密切相关.1995年在对美国某农产进行调查时，发现该农场工人NHL的发病率高于没有接触有机磷农药人群. 有机磷农药具有遗传毒性，可导致基因内部DNA的改变，并引起一定的表型变化.有研究表明，暴露在不同浓度的甲基对硫磷、甲基吡啶磷、敌敌畏条件下，可以导致黑腹果蝇三期幼虫两个遗传标记点的交叉杂合，在表型上观察到果蝇翅膀大小和形状的突变.早有报道久效磷具有遗传毒性，可导致生物机体的一系列生化指标如血浆蛋白含量、肝脏的DNA和RNA含量等改变.敌百虫、敌敌畏和乙酰甲胺磷可以显著诱发中国仓鼠（Phodopus griseus）
有机磷农药的微生物降解技术
有机磷农药的微生物降解技术 金潇，颜冬云，秦文秀 （青岛大学化学化工与环境学院,山东青岛266071） 摘要：有机磷农药的微生物降解技术具有成本低、不产生二次污染等优点，逐渐为人们所关注。为此，介绍了微生物降解的生物种类，并对其获得方法、降解机理、影响因素及基因工程菌的构建与应用等方面的研究进展进行了综述。 关键词：有机磷农药；微生物降解；影响因素；基因工程菌 中图分类号：X592文献标识码：A文章编号：1006－060X（2011）09－0093－05 Technology of Microbial Degradation for Organophosphorus Pesticides JIN Xiao,YAN Dong-yun,QIN Wen-xiu (College of Chemical Engineering and Environmental Sciences,Qingdao University,Shandong266071,PRC) Abstract:Technology of microbial degradation organophosphorus pesticides has gradually gathered significant environmental concerns for its low cost and no-secondary pollutions.This paper mainly introduced the biological species for microbial degradation,and the advances in obtaining methods of degrading microorganisms,degrading mechanism, influencing factors,construction and application of genetic engineering strains were summarized. Key words:organophosphorus pesticides;microbial degradation;influencing factor;genetic engineering strains 有机磷农药（Organophosphorus pesticides，Ops）是一种在环境中广泛使用的杀虫剂，具有高效、广谱等优点，自20世纪60年代以来，逐渐取代了有机氯农药。 随着有机磷农药的大量使用，其负面影响日益突出。残存于作物、土壤或水体中的有机磷农药，经物理迁移或化学转化，最终通过食物链的传递和富集作用影响人类及其他有益生物体[1]。1999~ 2001年，Abdel-Halim等[2]对一杀虫剂制造厂污水管道附近的污水、底泥和鱼类进行采样研究，结果表明，6份不同季节的样品中均存在毒死蜱、甲基毒死蜱、二嗪农、甲基嘧啶磷和溴丙磷。其中，毒死蜱在所有的水样和底泥样品中为主要污染物，浓度范围分别为24.5～303.8ng/L、0.9～303.8ng/L，二嗪农在鱼类样品中为主要污染物。 有机磷农药的降解方式主要分为生物降解、光化学降解、化学降解等3种，其中微生物降解具有操作简单、成本低、代谢繁殖快，对污染物氧化完全，不会产生二次污染等优点[3-5]。为此，本文综述了有机磷农药微生物降解技术，以期为环境中有机磷 农药的消解提供技术支撑。 1降解菌种类 目前，人们已分离出多种能降解有机磷农药的微生物菌群，其中包括细菌、放线菌、真菌和一些藻类。 由于细菌具有生化多适应性及易诱发突变菌株等优势，故其在微生物降解中占有重要地位[6-7]。至今，已分离到的细菌主要有：假单胞菌属（Pseu－domonas）、芽孢杆菌属（Baccillus）、黄杆菌属（Flavobacterium）、不动杆菌属（Acinetobacter）、节杆菌属（Arthrobacter sp.）、沙雷氏菌属（Serratia sp.）等。金彬明等[8]从被有机磷污染的海水样中分离筛选出一株蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）菌株，在28℃下对甲胺磷（5mg/L）的降解率达48.9％。解秀平等[9]从污水曝气池中分离得到一株能以甲基对硫磷及其降解中间产物对硝基苯酚为唯一碳源的节杆菌属（Arthrobacter sp.）菌株，在5h内对50mg/L的甲基对硫磷和对硝基苯酚的降解率分别为85％和98％。 真菌因其高效的降解能力正逐渐引起人们的重视，主要有：曲霉属（Aspergillus）、木霉属（Trichoder－ma）、青霉属（Penicillium）、酵母菌等。颜世雷等[10]通过长期摇床驯化培养从污染土壤中筛选出两株可在高浓度氧化乐果环境下生长的曲霉菌株，在28℃时对氧化乐果的降解率分别为70.38％和61.28％。此外，某些藻类对有机磷农药也有一定的降解作 收稿日期：2011-01-18 基金项目：土壤与农业可持续发展国家重点实验室开放基金 （Y052010023） 作者简介：金潇（1990-），女，山东菏泽市人，本科生，研究 方向为环境污染与控制。 通讯作者：颜冬云 湖南农业科学2011，（9）：93~97Hunan Agricultural Sciences