无细胞蛋白质合成系统研究进展

无细胞蛋白质合成系统研究进展
【摘要】：无细胞蛋白质合成系统是一种以mRNA或DNA为模板，在细胞提取物的酶系中补加各种底物和能源物质来合成蛋白质的体外系统。

与传统的细胞表达系统相比，体外无细胞合成系统具有很多优点，如：表达周期短，反应条件易控制，可表达对细胞有毒害作用的特殊蛋白质，易于进行蛋白质纯化和表达调控的研究等。

文章介绍了蛋白质体外合成系统的发展历程，研究中遇到的各种阻碍和相应的解决方案及其应用前景。

【关键词】：蛋白质合成; 无细胞系统; CFCF系统
无细胞蛋白质合成系统是一种以mRNA或DNA为模板，在细胞提取物的酶系中补加各种底物和能源物质来合成蛋白质的体外系统。

随着人类基因组计划的完成和蛋白质组学研究计划的开展，无细胞蛋白质合成系统已作为蛋白质组学研究最常用的工具而被重点地研究、发展和应用。

目前使用的无细胞蛋白质合成系统主要有原核的大肠杆菌系统，真核的麦胚抽提物系统和兔网组织红细胞裂解系统，也有的使用嗜热性细菌提取物，酵母细胞抽提物，最近还兴起了一种细胞壁缺陷的L-型细菌表达系统。

1. 无细胞蛋白质合成系统的主要优越性
同传统的体内重组蛋白质体系相比，体外无细胞合成系统具有以下几个优点：1）由于反应条件容易控制与调节，有利于蛋白质的合成和翻译后修饰的研究。

2）通过加入人工合成的氨酰-tRNA合成含有非天然氨基酸的特殊蛋白质。

3）方便研究各种信息调节因子对蛋白质合成的影响。

4）能够直接以PCR产物为模板合成蛋白质，可进行突变蛋白的快速筛选。

5）产物蛋白质含量高达1㎎/ml，便于蛋白质的纯化和后期直接研究。

6）无论是同源或异源的mRNA在无细胞合成系统中都能忠实而有效地翻译成相应的多肽和蛋白质。

7）能避免宿主细胞本身的基因调控机制在一定程度上对外源基因有效表达的影响以及宿主细胞的酶系对合成蛋白质的分解作用。

8）体外翻译蛋白质能有效避免合成的有毒蛋白质对宿主细胞的不利影响。

2. 无细胞蛋白质合成系统中遇到的几个关键问题及其相应的解决方法
2.1能量供应问题
蛋白质合成是一个大量耗能的过程，随着合成的进行体系中的能量越来越少，即使不进行合成反应，体系中的能量也会被各种磷酸酶所分解。

传统的方法是往系统中添加ATP以及二次能量生成物，如磷酸烯醇式丙酮酸（PEP），磷酸肌酸（CP）和乙酰磷酸（AP），这三种二次能源物质在相应的外源激酶作用下，可以使体系中的ADP重新生成ATP。

这样虽然保证了能量供应但在释放能量的
过程中产生了磷酸盐，而当体系中的磷酸盐浓度超过30mM将抑制蛋白质的合成。

于是人们开始寻找新的能量供应途径。

Kim 和Swartz[1]报道了向大肠杆菌体系中加入草酸盐作为磷酸烯醇式丙酮酸合成酶的抑制剂，能够提高ATP的再生效率，将体系中的ATP浓度提高了大约47%并且能有效避免无机磷的积累。

Swatrz和Kim还研究出，通过在体系中加入酶抑制剂或通过改变正常的代谢途径使一些耗能步骤的酶失活，就能大量节省能量，如使用细胞壁缺陷的L-型细菌来制备无细胞反应的提取成分。

Sang H K等[2]通过移走 E.coli S30提取物中的磷酸盐，降低了无机磷酸对合成的抑制作用，从而使蛋白质合成量增加30%。

同时人们也开始考虑多步酶反应和完全的能量代谢途径产生能量，即利用糖酵解和氧化磷酸化途径，这种方式不但能降低能量的成本还能有效的延长反应的时间。

KaraA和JameseR[3]已经设计出用PANOxSP(PEP, amino acids, NAD,oxalic acid, spermidine, and putrescine), cytomim和葡萄糖作为能源来维持无细胞系统的能量供应。

2.2 遗传模板的稳定性问题
由于无细胞合成体系中存在降解mRNA的酶，随着反应的进行，mRNA会被逐步降解。

编码目标蛋白的mRNA是整个合成体系中最脆弱的成分之一，它的数量和稳定性极大地影响蛋白质的合成速率和产量。

通常科研人员采用以下措施来解决这个问题：首先利用寡聚体固定mRNA，由于真核细胞的mRNA有5ˊ帽子结构和3ˊ-poly（A）尾巴，可以利用3ˊ-poly（A）尾巴将其固定在纤维素介质的寡聚dT上，提高mRNA的稳定性。

其次，对mRNA 进行化学修饰或者引入5′或3′次级结构，化学修饰有：2ˊ-O-乙酰基基团修饰mRNA，硫代磷酸基团修饰mRNA；次级结构有：在3ˊ端引入茎环结构，在5ˊ端引入稳定转录但不能翻译的首序列，以保护mRNA免受核酸酶的攻击。

再次，加入某些金属离子和沸石，在反应体系中加入Cu2+，沸石或非特异的线状DNA 能提高mRNA的稳定性。

Nishimura[4]等在大肠杆菌的无细胞体系中加入Cu2+，提高了蛋白质的表达量。

经研究发现Cu2+不仅能抑制核糖核酸酶的活性,而且能抑制磷酸酯酶的活性，从而促进蛋白质的合成。

Jung等[5]在麦胚提取物的无细胞合成系统中加入沸石，结果发现沸石能使体系中的mRNA更稳定。

但是目前对其作用机制还不是很清楚。

Watzele 等[6 ]发现,在体系中添加非特异的线状DNA可以使编码目标蛋白模板的稳定性提高。

该实验成功的理论基础在于在无细胞蛋白质翻译系统中转录与翻译是相耦联的，且作为模板的DNA是碱基数很少的线状分子。

2.3 钾离子供应形式问题
k+是无细胞系统合成的必不可少的成分，且其供应方式影响蛋白质的表达效率以及同位素标记的稳定性。

Jewett和Swartz[7]用L-型谷氨酸钾作为钾离子供体，在一毫升体系中，八小时内合成了6mg的CAT蛋白，但是L-谷氨酸系统不适合用于磁核共振的稳定同位素标记，而且要求钾离子浓度达到200mM。

若用乙酸钾作为钾离子供体，其系统适合统一的稳定同位素标记，但其产量仅为L-谷氨酸系统的一半。

Takayoshi Matsuda [8]等用D-型谷氨酸钾代替L-型谷氨酸钾，
蛋白的产量是使用乙酸钾的两倍，而且适合稳定同位素标记，极大地降低了同位素标记的成本，对蛋白质的结构分析致关重要。

3. 目前无细胞合成系统的研究热点
3.1 提高蛋白质合成效率和目标蛋白在反应液中的浓度
以前大量的研究集中在延长无细胞系统的反应时间，近年来人们更多的关注在于如何提高反应的效率和目标蛋白在终产物中的浓度。

真核细胞mRNA的5’ 和3’UTRs的序列在基因表达校准中扮演重要角色——控制mRNA翻译的高效、稳定和准确定位性。

但Yaeta Endo[3]等研究发现在体外翻译中，这些序列却有许多限制，帽子分子和戴帽的mRNA竞争着与起始因子elF4E结合，会抑制翻译起始，并且使mRNA的最适浓度范围变窄。

而且，为了有效表达，在表达开始之前我们倾向于精确测定mRNA，但在高产量蛋白翻译中，大量基因存在这一步骤会变得冗长。

研究表明拥有GAA-71作为5’增强子和1626nts 3’-UTR 的mRNA模板在最适浓度时有最好的模板活性，与拥有5’-poly（A）和一个100 ntpoly（A）以及549 nts 3’ UTR的原始mRNA有相似之处，用这样的模板进行体外表达其蛋白合成效率明显获得提高。

Hideo Nakano[8]等通过使用聚乙二醇（PEG）对麦胚提取物进行浓缩，发现在浓缩的提取液中起始的蛋白合成效率是70ugml-1h-1,大约是传统的没浓缩的起始速率的10倍。

Takashi Endoh[9]等使用新的嗜热杆菌裂解液作为翻译系统，在65℃条件下进行反应，在起初的15分钟就有超过100ug/ml的目标蛋白被合成，大约是传统翻译系统的90倍。

但是麦胚浓缩和嗜热杆菌系统最大的缺陷便是反应过早的被终止了，目前科研人员正致力于如何延长这两系统的反应时间。

3.2 CFCF系统的改进
由于CFCF系统不适合DNA文库的大量克隆表达，产量较低以及操作复杂，使得CFCF系统的应用受到了很大的限制，Kim D M等认为CFCF产量低的原因是由于超滤过程不但滤掉了产物，而且也滤掉了系统必须的小分子蛋白，如起始因子等。

在此基础上他们简化了CFCF，发明了没有超滤膜的CECF系统，在此系统中由渗透膜代替超滤膜，与CFCF系统不同的是，CECF系统的底物和副产物通过渗透膜自动扩散的，底物能有效地进入反应器，副产物能扩散到贮存罐，而产物蛋白则被一直留在反应器中。

T Sawasaki[10]等则进一步设计了一个更简单的双相微型无细胞合成反应器，底物通过两相界面扩散到翻译混合物中，而副产物通过两相界面的扩散到底物系统中，这种反应器没有使用超滤膜或渗透膜，操作更加方便。

更加简便和高效的自动化合成系统也正在研发当中。

4. 发展前景
蛋白质组计划的提出对无细胞蛋白质合成系统的发展有相当大的促进作用，随着我们对各种生命机制的研究深入，尤其是体内蛋白的合成研究的深入，可以为无细胞合成系统提供更多的理论依据，无细胞合成系统已被用来研究各种特殊的蛋白作用机制和高通量蛋白的合成。

随着无细胞系统自动化的不断完善和系统
成本的不断降低，无细胞系统将走出实验室被运用到工业化生产中来，在未来的科学研究中发挥极其重要的作用。

参考文献
[1] Dong-Myung Kim，James R. Swartz. Oxalate improves protein synthesis by enhancing ATP supply in a cell-free system derived from Escherichia coli [J]. Biotechnology Letters，1985，22：1537-1542.
[2] Sang H K，Taek J O，Ryang G K，Taek J K，Seung H H，Eun Y L，Cha Y
C.An efficient cell-free protein synthesis system using periplasmic phosphatase-removed S30 extract[J].Journal of Microbiological Mefhods，2000，43：91-96.
[3] Yaeta Endo and Tatsuya Sawasaki. Methods in Molecular Biology, vol. 310: Chemical Genomics: Reviews and Protocols.
[4] Nishimura N, Kitaoka Y, Niwano M. Utilization of copper ion as a ribonuclease inhibitor in a cell-free protein synthesis system[J]. J Ferment Bioeng ,1994 ,78 :130～133.
[5] Jung G Y, Lee E Y, Kim Y E , jung B W, Kang S H , Choi C Y. Stabilization effect of zeolite on DHFR mRNA in a wheat germ cell2free protein synthesis system[J]. J Biosci Bioeng ,2000 ,89 (2) :193～195.
[6] Watzele M, Hoffmann T , Nemetz C , Heindl D , Metzler T , Mutter W. Method for improving the stability of linear DNA in cell2free in vitro transcription Ptranslation systems[J]. US Patent 20030073201 ,2003
[7] Jewett MC, Swartz JR. Substrate replenishment extends protein synthesis with an in vitro translation system designed to mimic the cytoplasm. Biotechnol Bioeng, 2004,87:465–472.
[8] Hideo Nakano，Tadaaki Tanaka，Yasuaki Kawarasaki，Tsuneo Yamane. Highly productive cell-free protein synthesis system using condensed wheat-germ extract[J]. Journal of Biotechnology，1996，46：275-282.
[9] Takashi Endoh，Tamotsu Kanai，Tadayki Imanaka. A highly productive system for cell-free protein synthesis using a lysate of the hyperthermophilic archaeon，Thermococcus Kodakaraensis [J]. Appl Microbiol Biotechnol，2007，74：1153-1161.
[10] Sawasaki T, E Yamaguchi-Nunokawa, K Kodama, et al. Selenomethionine incorporation into a protein by cell-free synthesis[J]. J Struct Funct
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