乌头生物碱含量测定方法现况

综 述

乌头生物碱含量测定方法现况河北医科大学中医学院 张国红　由会玲　刘云肖(石家庄050091)

提要　综述了乌头生物碱的含量测定方法,并对各测量方法进行了分析和比较。

关键词　乌头;生物碱;含量测定

中图分类号:R28412 文献标识码:B 文章编号:1007-5615(2000)01-0045-03

川乌为毛茛科植物Aconrtum carmichaeli De2 bx的干燥母根,草乌为毛茛科植物Aconitum Kusnezo ffii的干燥块根,为临床常用中药,具祛风除湿止痛的功效。临床多用于治疗风湿性关节炎。近年,又有用于抗癌止痛的倾向。但是,乌头有大毒,因此,对乌头中的有效成分和毒性成分进行含量测定,以确保临床用药的安全性和有效性,是很有必要的。生物碱类成份是乌头的主要有效成份和毒性成份。以下,对生物碱的含量测定方法做一综述。

1　总生物碱成份的测定

　111　中和法[1]　此法为测定生物碱的经典方法,为1990年版中国药典所采用。分为直接滴定法和回滴定法。直接滴定法终点突破不明显,难于判断;回滴定法灵敏度低,有较大误差。

　112　交流示波极谱滴定法[2]　此法测定终点直观,准确,但受pH影响大,需特殊仪器。

　113　酸性染料比色法[3～6]　是利用生物碱和酸性染料反应生成离子对而进行比色测定的方法。根据所用酸性染料的不同,又分为溴麝香草酚蓝法、溴甲酚绿法、甲橙提取比色法等。利用酸性染料比色法测定生物碱总量时,要注意符合比尔定律的含量范围,水相pH的选择,呈色的稳定性。从呈色稳定性考虑,甲橙提取比色法优于溴甲酚绿法。溴甲酚绿法优于溴麝香草酚蓝法。

　114　导数分光光度法[7,8]　可设定不同的求导阶数以清除干扰组分的吸收。利用导数分光光度法,样品经乙醇提取后,不经分离即可直接测定,测定结果与药典法比较,无显著差别,但该法更灵敏、准确、简便,且提取溶剂乙醇比氯仿对人体更安全。

以上4种总生物碱提取方法,以导数分光光度法最为简便,且分光光度计为常备仪器,因此笔者认为该法对于测量总生物碱为最佳方法,适于药厂使用。

乌头中总生物碱是有效部位,因此用总生物碱含量来衡量乌头的药效大小是可行的。但是,不能用总生物碱含量作为毒性指标。因为乌头总生物碱中包括双酯型生物碱、单酯型生物碱、氨醇型生物碱和其他类生物碱,这几种生物碱的毒性差异极大:单酯型生物碱为双酯型生物碱的1/5～1/10,氨醇型生物碱为双酯型生物碱的1/2000～1/4000,同样含量的总生物碱,若这几种生物碱的比例不同,总生物碱的毒性也不相同。因此,乌头的毒性指标应以双酯型生物碱含量为指标。

2　乌头碱的含量测定

　211　荧光薄层法[9]　该法灵敏度高,分析速度快,但需特殊仪器—荧光分光光度计。

　212　纸上电泳分离—洗脱分光光度法[10]　该法对乌头碱的分离效果好,但所需时间长。

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　213　薄层扫描法[11]　该法具有专属性强,

准确度高的特点。　214　乌头碱—PVC 膜电极法[12]　该法操作简便,碱性水解产物对测定干扰少,电极的重现性好,如果采用盐酸法制备样品,不需要采用有机溶媒提取的繁琐过程。该法的缺点是:在方法学上还不够成熟,需要对浸泡时间及过滤等环节作进一步考证,且制备乌头碱—PVC 膜电极比较麻烦。

以上4种乌头碱含量测定方法,笔者认为以薄层扫描法为最好。该法操作简单,专属性强,准确度好,方法成熟。

但是,仅以乌头碱的含量为指标,不能控制乌头的毒性,因为双酯型生物碱是乌头的主要毒性成分,乌头中所含的毒性生物碱有乌头碱、中乌头碱、次乌头碱等多种生物碱,这些双酯型生物碱的毒性相当。而乌头碱只是这些双酯型生物碱的组分之一。因此,单以乌头碱的含量为指标。无法真实反映乌头的毒性大小,而且不同产地的乌头中所含的双酯型生物碱的种类也不同。例如甘肃、广西乌头中只含中乌头碱,北京乌头中只含中乌头碱和次乌头碱,四川乌头中则3种生物碱都有[13]。如果仅以乌头碱含量为指标,则甘肃、广西、北京三地所产乌头应是无毒的,但事实并非如此。3　酯型总生物碱的含量测定

　311　改良盐酸羟胺—高氯酸铁比色法[14]　反应原理为酯型生物碱与羟胺反应生成异羟肪酸,再与Fe +++生成紫红色的络合物,进行比色。该法在盐酸羟胺—高氯酸铁比色法的基础上进行了改良,即在异羟肪酸反应—高氯酸铁显色后,于异羟肪酸反应液中加入一定量pH 值为015的高氯酸水溶液,使空白无色。改良后的盐酸羟胺—高氯酸铁比色法使空白在测量波长范围内的吸收消失,消除了其他组分的干扰,提高了检出灵敏度,使显色保持了良好的稳定性。

利用酯型总生物碱含量为指标控制乌头的毒性,也是不合理的。因为酯型总生物碱包括

单酯型生物碱和双酯型生物碱,而这两种生物

碱的毒性大小不同,单酯型生物碱的毒性仅为双酯型生物碱毒性的1/5～1/10,如果这两类生物碱的配比不同,既使是相同量的酯型总生物碱也会表现出不同的毒性。41　双酯型生物碱的含量测定

　411　反相高效液相法[15～20]　根据干扰组分的干扰情况,可分别采用普遍HP LC 法。反相离子对HP LC 法或T LC —HP LC 法,对双酯型生物碱乌头碱、中乌头碱、次乌头碱进行分离测定。可控制流动相组成和配比,使各类双酯型生物碱达到基线分离,方法简便,分离效果好,重现性高。常用的流动相有甲醇—水—氯仿—三乙胺系统、甲醇—水—氯仿—二乙胺系统和甲醇—水—乙腈系统,可根据不同情况,灵活选择流动相。乌头碱在二氯甲烷中比较稳定,而在甲醇中则不稳定,一个星期就发生分解,因此在用高效液相法测定双酯型生物碱含量时,用二氯甲烷做定容溶剂较好。另外,在样品提取过程中,应注意操作要迅速,如提取时间过长,则乌头碱水解,影响测定结果。　412　双波长薄层扫描法[21]　该法同样可以灵活选用展开剂,使乌头碱、中乌头碱、次乌头碱达到良好分离,且含量测定的结果准确可靠、精密度良好,回收率稳定,且操作简便、快速,不需特殊仪器,适于基层使用。线性范

围为2～6μg 。

　413　高效毛细管电泳法[22]　该法与HP LC 相比,具有分离时间更短、杂质干扰更少、使用有机溶剂少、操作简便等优点,满足乌头类药材分析的要求,且获得的结果令人满意。该方法已被香港工业署组织的中药质量控制实验室用作有毒中药材的质量管理控制,是一种很有应用前景的分析方法。

上述3种双酯类生物碱含量测定方法中,双波长薄层扫描法操作简便、快速、不需要特殊仪器,适合基层单位使用。而反相HP LC 法和高效毛细管电泳法则以用样品量少、快速、适合微量分析见长。随着分析方法的进步,含

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