红霉素摇瓶发酵实验工艺条件
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摇瓶发酵实验一般不能在整个发酵周期内只选 取一个最合适的培养温度和 pH 值。
根据经验及有关文献报道[1], 将发酵后期温度 控制在 (29±0. 5) ℃, pH 值控制在 7. 0～ 7. 2 之间。
采用正交设计进行考察。 各因素水平见表 1。 摇瓶发酵采用 2 级发酵, 转速为 220 r m in, 全 程补料培养。 正交实验结果见表 2。
1 390
8
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1
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2 301
2 239
2 264
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1
2 331
2 337
2 408
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K j1
6 916
6 277
7 562
6 281
K = 19 305
K j2
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6 598
7 621
7 101
K j3
5 975
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4 122
5 923
Λ=
K N
=
2
145
(西北大学 化学工程学系, 陕西 西安 710069)
摘要: 主要研究了红霉素摇瓶发酵工艺条件对发酵水平的影响。通过正交实验得到了优化的发酵温 度为: 前期温度 35℃, 中期温度 31℃, 后期温度 (29±0. 5) ℃。 同时, 得到优化的前期和中期 pH 值 均为 6. 8。 利用均匀设计, 得出了优化补料配方, 使效价提高约 3. 8% , 同时得到了效价与各基质浓 度的回归方程。 由实验得到了一组优化的摇床转速控制方式和优化的前体添加水平。 通过以上的 工艺条件优化, 使摇瓶发酵红霉素效价提高约 47. 3%。 关 键 词: 红色链霉菌; 发酵工艺; 优化设计 中图分类号: TQ 92 文献标识码: A 文章编号: 10002274 (2000) 0120043204
4 摇瓶发酵实验
摇瓶发酵实验一般分为 3 级发酵, 即 1 级种子 表 1 各因素的水平值
Tab. 1 Va lue of level of each factor
因子
水 平
1
Fra Baidu bibliotek
2
3
前期温度 A ℃
35
33
31
前期 pH 值 B
6. 4
6. 8
7. 2
中期温度 C ℃
29
31
33
中期 pH 值 D
7. 2
试 验 号
1 葡萄糖 2 黄豆饼粉 3 硫酸铵
4 酵母粉
5 玉米浆
效价 1
效价 2
效价 3
IU ·mL - 1 IU ·mL - 1 IU ·mL - 1
1
13
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—
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—
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2 864
3 第 5 组为对照实验, 各组实验培养条件: 0～ 48h, 35℃, pH 6. 8; 48～ 144h, 31℃, pH 6. 8; 144～ 168h, 29℃, pH 7. 0～ 7. 2;
补料培养, 其他条件同前。
从表 3 可以看出, 采取第 2 级方案发酵水平最 酸铵、酵母粉等。着重考察其中 5 个因素: 葡萄糖、黄
由表中可看出, 诸因素对发酵水平影响的程度 是: C > D > A > B 。 取 B 为误差项进行方差分析[2], 最后得到优化水平搭配为A 1B 2C 2D 2, 恰为第 2 组实
验。 与对照实验相比, 无论是基质 (包括还原糖、总 糖、氨基氮) 消耗, 还是菌体浓度均高。 在发酵中期, 第 2 组实验的效价增长率为 35. 7 个单位 h, 高于对
培养, 2 级种子培养及发酵, 其完整周期为 12 d。 对 1 级种子培养和 2 级种子培养进行比较, 并
考虑蒸发原因, 结果二者差别不大。为了缩短发酵时 间及减少染菌率, 一般都省去 2 级种子培养, 而直接 采用 1 级种子进行发酵培养, 其完整周期约为 10 d。 4. 1 温度、pH 值对红霉素发酵水平的影响
Tab. 3 Inf luence of the speed of shaker on ferm en ta tion
组次 1 2 3 4 53
t150 r·m in- 1 0～ 24 0～ 12 — — —
t220 r·m in- 1 24～ 36 12～ 24 0～ 24 0～ 48 0～ 168
2 主要仪器与设备
离心机, L G1022. 4A , 北京医用离心机厂; 摇床, T Z22DB , 北京沃德电子实验设备厂; 分光光度计, 721 型, 上海第三分析仪器厂; 蒸汽消毒器, YX 2280, 江阴医疗设备厂。
3 红霉素效价的测定
红霉素效价的测定, 一般有生物效价法与化学 效价法。 其中, 生物效价法最为精确, 而化学效价法 与之相比, 误差在 0. 3% 左右。 由于实验条件所限, 本实验采用化学效价法。本法是硫酸水解法, 即红霉 素经硫酸水解后呈黄色, 于 483 nm 处有极大吸收 值, 可以定量测定。
二级种子培养基, 121℃下灭菌 30 m in。 接种量为 10% , 33℃下培养 48 h, 摇床转速为 220 r m in。 11313 发酵培养 摇瓶为 500 mL 三角瓶, 装液量 50% , 接种量 10% , 温度、pH 值、转速由实验进行优 化选择, 发酵时间为 7 d。参照西安制药厂的工艺要 求及有关资料, 在发酵中期, 还原糖浓度一般控制在 0. 8%～ 1. 5% 之间, 氨基氮浓度控制在 4 m g mL 左 右。
红霉素系红色链霉菌 (S trep tom y ces E ry th reus) 产生的大环内酯类抗生素。 控制好微生物发酵参数 是提高抗生素发酵水平的关键[6]。 红霉素的产生取 决于菌丝的生长活力, 在营养期内应控制菌丝使其 具有较高的呼吸活力和磷酸酶、蛋白酶、淀粉酶等的 活力。 在合成期, 要提高红霉素的产量, 须将菌体控 制在最适生长点以下。 本实验主要是考察温度、pH 值、摇床转速控制方式、补料工艺及前体添加对红霉 素摇瓶发酵水平的影响, 以有助于工业发酵。
1
1
1
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1
2 571
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2 956
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—
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1
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3 259
3 315
3 278
13 表示葡萄糖浓度取 1 水平, 其余类同。
实验结果利用逐步回归法[4], 求得回归方程为
来考察其对红霉素发酵水平的影响。 补料分为补糖 排实验。 实验安排及结果见表 4。
即补葡萄糖与补混合料, 包括黄豆饼粉、玉米浆、硫
表 4 红霉素发酵均匀设计表
Tab. 4 Table of the un iform ity exper im en ta l design of erythrom yc in ferm en ta tion
收稿日期: 1999205219 基金项目: 陕西省政府重大攻关资助项目 (96K122G11) ; 国家自然科学基金资助项目 (29706007) 作者简介: 范代娣 (19652) , 女, 陕西西安人, 西北大学副教授, 博士, 主要从事生物化工研究。
— 44 — 西北大学学报 (自然科学版) 第 30 卷
按 原 配 方 浓 度, 结 果 为 3 305 个 单 位, 与 预 测 值
3
360个单位较相符。 故认为
x
5 1
x
52x
4 3
合适。 最后,
对
实验结果与原配方进行对比, 最大菌体浓度由 40%
升至 41% , 故化学效价提高约 3. 8%。 4. 4 前体添加对红霉素发酵水平的影响
据有关报道[5], 在对红霉素生物合成有影响的 有机酸及醇类中, 发现丙醇有明显作用。我们在摇瓶 发酵中, 考察了 6 种不同添加水平的丙醇对红霉素 发酵的影响。 实验安排和结果见表 5。
y = 17. 19x 1 + 84. 44x 2 - 359. 57x 3 + 2 219. 25,
式中: y —红霉素效价; x 1—葡萄糖浓度; x 2—黄豆饼
粉浓度; x 3—硫酸铵浓度。
经验证,
我们选取优化配方
x
5 1
x
52x
4 3
,
(
x
5 1
表示葡
萄糖浓度为第 5 水平, 其余类同)。 酵母粉与玉米浆
第 6 期 范代娣等: 红霉素摇瓶发酵实验工艺条件 — 4 5 —
照实验的 30. 3 个单位 h。
的。 我们设计了 4 组调节摇床转速的方案, 见表 3。
4. 2 摇床转速对红霉素发酵水平的影响
菌体在不同的生长、代谢阶段, 其需氧量是不同
表 3 摇床转速对发酵水平的影响
2000 年 2 第 30 卷第
1月期
西北大学学报 (自然科学版)
Jou rna l of N o rthw est U n iversity (N a tu ra l Science Ed ition)
Feb. 2000 V o l. 30 N o. 1
红霉素摇瓶发酵实验工艺条件3
范代娣, 党 政, 孙晓红, 尚龙安, 米 钰, 马 沛, 藩新岭
t300 r·m in- 1 36～ 72 24～ 72 24～ 48 48～ 144 —
t220 r·m in- 1 72～ 144 72～ 144 48～ 144 144～ 168
—
t150 r·m in- 1 144～ 168 144～ 168 144～ 168
— —
效 价 IU ·mL - 1 3 137 3 182 3 115 3 011 2 938
6. 8
6. 4
表 2 红霉素发酵正交实验设计表 Tab. 2 Table of the regression orthogona l exper im en t design of ferm en ta tion of erythrom yc in
试
A
B
C
D
效价 1
效价 2
效价 3
平均值
验
号
前期温度 ℃ 前期 pH 中期温度 ℃ 中期 pH IU ·mL - 1 IU ·mL - 1 IU ·mL - 1 IU ·mL - 1
高, 效价达 318 2 个单位, 比对照实验提高 8. 3%。
豆饼粉、硫酸铵、酵母粉、玉米浆。每个因素取 5 个水
4. 3 补料配方对红霉素发酵水平的影响
平, 采用均匀设计[3]。 为提高实验精度, 采用拟水平
在摇瓶发酵实验中, 通过改变补料培养基配方 法。每个因素虚拟为 10 个水平, 利用U 10 (10) 5 表安
1 材料与方法
1. 1 菌 种 红色链霉菌 (S trep tom y ces E ry th reus) , 由西安
制药厂提供。 1. 2 培养基
淀粉、黄豆饼粉、花生饼粉、玉米浆、酵母粉、硫 酸铵、葡萄糖、碳酸钙、蛋白胨等 (配方略)。 1. 3 培养方法 11311 一级种子培养 以 10% 的装液量装入一级 种子培养基, 121℃下灭菌 30 m in。 接种量为 1 cm 2 斜面培养基, 接种后置于摇床内振荡培养, 33℃下培 养 72 h, 摇床转速为 220 r m in。 11312 二级种子培养 500 mL 三角瓶内装 50 mL
在发酵液经离心后, 根据确定好的倍数吸取一 定量的滤液, 用 0. 35% 碳酸钾液稀释。然后, 取稀释 液 20 mL 于分液漏斗中, 加入醋酸丁酯 20 mL , 振 摇 30 m in, 放置分层, 弃去下层水液, 于丁酯液中加 入无水硫酸钠 1 g 左右 ( 可酌量多加使丁酯液澄 清) , 振荡至透明。准确吸取其上层脱水液 10 mL 于 另一干燥的分液漏斗中, 精确加入盐酸 (0. 1 m o l L ) 10 mL , 振荡 30 m in, 放置分层, 把下层盐酸水液 放入试管中, 从中吸取 5 mL 放入另一试管中, 加入 硫酸 (8 m o l L ) 5 mL , 摇匀, 放入 50℃水浴中, 保温 30 m in 取出冷却。在 483 nm 处测定吸光度, 以蒸馏 水为空白, 用所得的吸光度值查标准曲线。效价= 查 出数×稀释倍数。
根据经验及有关文献报道[1], 将发酵后期温度 控制在 (29±0. 5) ℃, pH 值控制在 7. 0～ 7. 2 之间。
采用正交设计进行考察。 各因素水平见表 1。 摇瓶发酵采用 2 级发酵, 转速为 220 r m in, 全 程补料培养。 正交实验结果见表 2。
1 390
8
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K = 19 305
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K N
=
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(西北大学 化学工程学系, 陕西 西安 710069)
摘要: 主要研究了红霉素摇瓶发酵工艺条件对发酵水平的影响。通过正交实验得到了优化的发酵温 度为: 前期温度 35℃, 中期温度 31℃, 后期温度 (29±0. 5) ℃。 同时, 得到优化的前期和中期 pH 值 均为 6. 8。 利用均匀设计, 得出了优化补料配方, 使效价提高约 3. 8% , 同时得到了效价与各基质浓 度的回归方程。 由实验得到了一组优化的摇床转速控制方式和优化的前体添加水平。 通过以上的 工艺条件优化, 使摇瓶发酵红霉素效价提高约 47. 3%。 关 键 词: 红色链霉菌; 发酵工艺; 优化设计 中图分类号: TQ 92 文献标识码: A 文章编号: 10002274 (2000) 0120043204
4 摇瓶发酵实验
摇瓶发酵实验一般分为 3 级发酵, 即 1 级种子 表 1 各因素的水平值
Tab. 1 Va lue of level of each factor
因子
水 平
1
Fra Baidu bibliotek
2
3
前期温度 A ℃
35
33
31
前期 pH 值 B
6. 4
6. 8
7. 2
中期温度 C ℃
29
31
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中期 pH 值 D
7. 2
试 验 号
1 葡萄糖 2 黄豆饼粉 3 硫酸铵
4 酵母粉
5 玉米浆
效价 1
效价 2
效价 3
IU ·mL - 1 IU ·mL - 1 IU ·mL - 1
1
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3 第 5 组为对照实验, 各组实验培养条件: 0～ 48h, 35℃, pH 6. 8; 48～ 144h, 31℃, pH 6. 8; 144～ 168h, 29℃, pH 7. 0～ 7. 2;
补料培养, 其他条件同前。
从表 3 可以看出, 采取第 2 级方案发酵水平最 酸铵、酵母粉等。着重考察其中 5 个因素: 葡萄糖、黄
由表中可看出, 诸因素对发酵水平影响的程度 是: C > D > A > B 。 取 B 为误差项进行方差分析[2], 最后得到优化水平搭配为A 1B 2C 2D 2, 恰为第 2 组实
验。 与对照实验相比, 无论是基质 (包括还原糖、总 糖、氨基氮) 消耗, 还是菌体浓度均高。 在发酵中期, 第 2 组实验的效价增长率为 35. 7 个单位 h, 高于对
培养, 2 级种子培养及发酵, 其完整周期为 12 d。 对 1 级种子培养和 2 级种子培养进行比较, 并
考虑蒸发原因, 结果二者差别不大。为了缩短发酵时 间及减少染菌率, 一般都省去 2 级种子培养, 而直接 采用 1 级种子进行发酵培养, 其完整周期约为 10 d。 4. 1 温度、pH 值对红霉素发酵水平的影响
Tab. 3 Inf luence of the speed of shaker on ferm en ta tion
组次 1 2 3 4 53
t150 r·m in- 1 0～ 24 0～ 12 — — —
t220 r·m in- 1 24～ 36 12～ 24 0～ 24 0～ 48 0～ 168
2 主要仪器与设备
离心机, L G1022. 4A , 北京医用离心机厂; 摇床, T Z22DB , 北京沃德电子实验设备厂; 分光光度计, 721 型, 上海第三分析仪器厂; 蒸汽消毒器, YX 2280, 江阴医疗设备厂。
3 红霉素效价的测定
红霉素效价的测定, 一般有生物效价法与化学 效价法。 其中, 生物效价法最为精确, 而化学效价法 与之相比, 误差在 0. 3% 左右。 由于实验条件所限, 本实验采用化学效价法。本法是硫酸水解法, 即红霉 素经硫酸水解后呈黄色, 于 483 nm 处有极大吸收 值, 可以定量测定。
二级种子培养基, 121℃下灭菌 30 m in。 接种量为 10% , 33℃下培养 48 h, 摇床转速为 220 r m in。 11313 发酵培养 摇瓶为 500 mL 三角瓶, 装液量 50% , 接种量 10% , 温度、pH 值、转速由实验进行优 化选择, 发酵时间为 7 d。参照西安制药厂的工艺要 求及有关资料, 在发酵中期, 还原糖浓度一般控制在 0. 8%～ 1. 5% 之间, 氨基氮浓度控制在 4 m g mL 左 右。
红霉素系红色链霉菌 (S trep tom y ces E ry th reus) 产生的大环内酯类抗生素。 控制好微生物发酵参数 是提高抗生素发酵水平的关键[6]。 红霉素的产生取 决于菌丝的生长活力, 在营养期内应控制菌丝使其 具有较高的呼吸活力和磷酸酶、蛋白酶、淀粉酶等的 活力。 在合成期, 要提高红霉素的产量, 须将菌体控 制在最适生长点以下。 本实验主要是考察温度、pH 值、摇床转速控制方式、补料工艺及前体添加对红霉 素摇瓶发酵水平的影响, 以有助于工业发酵。
1
1
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—
3 142
10
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3
1
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3 259
3 315
3 278
13 表示葡萄糖浓度取 1 水平, 其余类同。
实验结果利用逐步回归法[4], 求得回归方程为
来考察其对红霉素发酵水平的影响。 补料分为补糖 排实验。 实验安排及结果见表 4。
即补葡萄糖与补混合料, 包括黄豆饼粉、玉米浆、硫
表 4 红霉素发酵均匀设计表
Tab. 4 Table of the un iform ity exper im en ta l design of erythrom yc in ferm en ta tion
收稿日期: 1999205219 基金项目: 陕西省政府重大攻关资助项目 (96K122G11) ; 国家自然科学基金资助项目 (29706007) 作者简介: 范代娣 (19652) , 女, 陕西西安人, 西北大学副教授, 博士, 主要从事生物化工研究。
— 44 — 西北大学学报 (自然科学版) 第 30 卷
按 原 配 方 浓 度, 结 果 为 3 305 个 单 位, 与 预 测 值
3
360个单位较相符。 故认为
x
5 1
x
52x
4 3
合适。 最后,
对
实验结果与原配方进行对比, 最大菌体浓度由 40%
升至 41% , 故化学效价提高约 3. 8%。 4. 4 前体添加对红霉素发酵水平的影响
据有关报道[5], 在对红霉素生物合成有影响的 有机酸及醇类中, 发现丙醇有明显作用。我们在摇瓶 发酵中, 考察了 6 种不同添加水平的丙醇对红霉素 发酵的影响。 实验安排和结果见表 5。
y = 17. 19x 1 + 84. 44x 2 - 359. 57x 3 + 2 219. 25,
式中: y —红霉素效价; x 1—葡萄糖浓度; x 2—黄豆饼
粉浓度; x 3—硫酸铵浓度。
经验证,
我们选取优化配方
x
5 1
x
52x
4 3
,
(
x
5 1
表示葡
萄糖浓度为第 5 水平, 其余类同)。 酵母粉与玉米浆
第 6 期 范代娣等: 红霉素摇瓶发酵实验工艺条件 — 4 5 —
照实验的 30. 3 个单位 h。
的。 我们设计了 4 组调节摇床转速的方案, 见表 3。
4. 2 摇床转速对红霉素发酵水平的影响
菌体在不同的生长、代谢阶段, 其需氧量是不同
表 3 摇床转速对发酵水平的影响
2000 年 2 第 30 卷第
1月期
西北大学学报 (自然科学版)
Jou rna l of N o rthw est U n iversity (N a tu ra l Science Ed ition)
Feb. 2000 V o l. 30 N o. 1
红霉素摇瓶发酵实验工艺条件3
范代娣, 党 政, 孙晓红, 尚龙安, 米 钰, 马 沛, 藩新岭
t300 r·m in- 1 36～ 72 24～ 72 24～ 48 48～ 144 —
t220 r·m in- 1 72～ 144 72～ 144 48～ 144 144～ 168
—
t150 r·m in- 1 144～ 168 144～ 168 144～ 168
— —
效 价 IU ·mL - 1 3 137 3 182 3 115 3 011 2 938
6. 8
6. 4
表 2 红霉素发酵正交实验设计表 Tab. 2 Table of the regression orthogona l exper im en t design of ferm en ta tion of erythrom yc in
试
A
B
C
D
效价 1
效价 2
效价 3
平均值
验
号
前期温度 ℃ 前期 pH 中期温度 ℃ 中期 pH IU ·mL - 1 IU ·mL - 1 IU ·mL - 1 IU ·mL - 1
高, 效价达 318 2 个单位, 比对照实验提高 8. 3%。
豆饼粉、硫酸铵、酵母粉、玉米浆。每个因素取 5 个水
4. 3 补料配方对红霉素发酵水平的影响
平, 采用均匀设计[3]。 为提高实验精度, 采用拟水平
在摇瓶发酵实验中, 通过改变补料培养基配方 法。每个因素虚拟为 10 个水平, 利用U 10 (10) 5 表安
1 材料与方法
1. 1 菌 种 红色链霉菌 (S trep tom y ces E ry th reus) , 由西安
制药厂提供。 1. 2 培养基
淀粉、黄豆饼粉、花生饼粉、玉米浆、酵母粉、硫 酸铵、葡萄糖、碳酸钙、蛋白胨等 (配方略)。 1. 3 培养方法 11311 一级种子培养 以 10% 的装液量装入一级 种子培养基, 121℃下灭菌 30 m in。 接种量为 1 cm 2 斜面培养基, 接种后置于摇床内振荡培养, 33℃下培 养 72 h, 摇床转速为 220 r m in。 11312 二级种子培养 500 mL 三角瓶内装 50 mL
在发酵液经离心后, 根据确定好的倍数吸取一 定量的滤液, 用 0. 35% 碳酸钾液稀释。然后, 取稀释 液 20 mL 于分液漏斗中, 加入醋酸丁酯 20 mL , 振 摇 30 m in, 放置分层, 弃去下层水液, 于丁酯液中加 入无水硫酸钠 1 g 左右 ( 可酌量多加使丁酯液澄 清) , 振荡至透明。准确吸取其上层脱水液 10 mL 于 另一干燥的分液漏斗中, 精确加入盐酸 (0. 1 m o l L ) 10 mL , 振荡 30 m in, 放置分层, 把下层盐酸水液 放入试管中, 从中吸取 5 mL 放入另一试管中, 加入 硫酸 (8 m o l L ) 5 mL , 摇匀, 放入 50℃水浴中, 保温 30 m in 取出冷却。在 483 nm 处测定吸光度, 以蒸馏 水为空白, 用所得的吸光度值查标准曲线。效价= 查 出数×稀释倍数。