BD流式分选的原理和应用

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肿瘤细胞的非整倍体分析
二倍体
异倍体
四倍体
➢ 正常细胞DNA量相同，癌变细胞的DNA指数发生变化，非整倍体出现概率很高。 ➢ 用流式DNA峰图鉴别细胞的倍体在病理学上是一种快速、直接的检测方法。
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植物倍体的分析
➢ 植物细胞的倍体非常复杂，常以多倍体形式存在。 ➢ 检测时多采用对数形式。 ➢ 植物的倍性鉴定是多倍体研究的重要内容之一。流式细胞术已应用于玉米、
细胞凋亡-Annexin Ⅴ/PI双标记法
FITC Annexin V/PI染色和流式细 胞仪分析。Jurkat细胞（人T细胞 白血病）用6µM的喜树碱或0.1% DMSO（阴性对照）4小时，引导凋 亡。细胞根据Annexin V-FITC凋亡 检测试剂盒的染色指南，用FITC Annexin V和碘化丙啶（PI）染色。 与DMSO对照组相比，喜树碱处理会 增加细胞的早期凋亡（PI阴性， Annexin V阳性），即图中绿色部 分。死细胞（PI阳性，红色部分） 和活细胞（Annexin V和PI阴性， 黑色部分）群体很容易辨别。图中 的数据来自BD Accuri C6流式细胞 的BD CFlow® Plus。
➢ Sub-G1峰的出现被认为是凋亡细胞的标志之 一。
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肿瘤细胞凋亡检测
方法：Jurkat细胞分别用DMSO（对照；<2%）或HU-331（一种诱导细胞凋亡的大 麻素； Cayman Chemical Company ）处理6小时。然后用Accuri Cell Cycle Phase Determination Kit (KR-300)固定细胞并染色。
流式对照的设置
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对照的设置
流式细胞术显示的荧光强度是相对的、可调节的， 所以需要设置一系列对照来确定细胞是否阳性。 ➢ 阴性对照 ➢ 阳性对照 ➢ 单染对照（补偿对照）
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对照的设置-阴性对照
➢ 空白对照：即不进行任何标记的细胞。主要用 于确定待测标本的自发荧光
➢ 同型对照：即用同型抗体作平行实验。同型抗 体为没有特异性、与荧光抗体亚型一致的免疫 球蛋白（即Fc段相同，Fab段不同）。用于确 认细胞是否为抗原特异性染色，排除非特异染 色。
➢ 1974年，BD与美国斯坦福大学合作研制出全球第一台商用流式细胞分选仪， 不断推陈出新，在流式细胞领域始终保持领先地位。
➢ 全球500强企业之一
市场情况
BD是全球最大的流式细胞仪生产商和供应商，在全球的占有 率为85%，高端分选型流式细胞仪占有率大于90%。
在全国各大医院和科研院所，大部分为BD公司的仪器，总计 数量已超过2000台， 如：清华大学，北京大学，中科院系统， 军科院系统，医科院系统等等
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对照的设置-阳性对照
➢ 阳性对照即应用已知表达某种抗原的细胞（阳 性细胞）进行平行实验。通常用于检测抗体是 否有问题或确定实验方法的稳定性、准确性。
➢ 与阴性对照一起判断测试样品是否为特异性染 色。
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对照的设置-单染对照（补偿对照）
➢ 补偿对照-多色荧光分析会有光谱交叉，需要荧光补偿 ➢ 几色分析需要设置几个补偿对照
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单染对照（补偿对照）-荧光补偿方法
530/40 580/30 0
FITC
PE
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流式细胞仪如何得到细胞
分选细胞 从复杂的细胞群体中得 到高纯度的靶细胞，进 一步深入研究
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高速分选原理
分选时，液流自驱动力的作用下断成高度均一的液滴。 在喷嘴下的几毫米处，液滴从液流断开。
从颗粒被检测到液滴断开的时间称为液滴延迟时间，由 BD专利的Accudrop技术直接计算
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检测范围
细胞结构组成 大小 粒度
DNA、RNA含量 蛋白质含量 钙离子、pH值、膜电位
细胞功能 细胞表面、胞浆、核特异性抗原
细胞活性 胞内细胞因子 激素结合位点
酶活性
流式细胞仪能告诉我们什么？
• 细胞的相对大小（前向角散射光信号，FSC） • 细胞的相对颗粒性及内部结构的复杂性（侧向散
射光信号，SSC） • 相关的荧光强度
符合分选条件的颗粒一旦被检测到，包含该颗粒的液滴 将要从液流断开时，液流被充电。断开后的液滴仍然带 电，带电的液滴通过被充电的偏转板。受静电吸引或排 斥，带电液滴将向左或向右偏转。不带电的液滴不偏转 而流入废液槽。
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部分应用实例
科学是复杂的，工具是简单的
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转染绿色荧光蛋白GFP细胞的分选
用带GFP (绿色荧光蛋白 ) 标记的质粒转染细胞， 在488nm激光激发下， 表达GFP 的细胞发绿色荧光。本实验为U937 细胞转染GFP和目的基因， 用BD FACSAria III 分选高表达GFP目的基因的细胞。本案例用BD FACSAria III 分选GFP阳性细胞， 该 样本GFP阳性的目标细胞含量仅为1 .9%， 分选后回测， 目的细胞纯度高达99%。
分选参数： 专利的BD FACS Accudrop技术 可拆卸偏转电极板 收集方式支持克隆及单细胞分析 等多种应用 分选仓内情况清晰可见
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BD FACSJazz配置及核心技术指标 （4）
软件系统： 更好的操控性能 直观的工作流程 强大的数据分析 索引分选让克隆研究更加高效
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BD FACSJazz配置及核心技术指标 （5）
液流系统
声学耦合喷嘴装置
新型液流控制台和分选软件
喷嘴装置：喷嘴使用螺口与系统耦合，取下 喷嘴清理时不会影响光路系统的校准
可更换液流管路
主要参数：
最小检测大小： 1um 最小上样体积： 200ul
分辨率： <3% CV 数据获取速率：最高200,000事件/秒
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BD FACSJazz配置及核心技术指标 （3）
BD公司流式细胞仪
FACSJazz
FACSAriaII
Influx
FACSCantoII
LSRFortessa
Accuri C6
流式细胞仪特点及检测标本
• 特异性强，灵敏度高，速度快，并能实现 多参数分析；
• 可检测的样本种类多样
– (1)外周血，骨髓，细针穿刺，洗脱液，实体组 织，培养细胞
– (2)血清、血浆、培养上清、细胞裂解液
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染色体分选
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肿瘤干细胞分选
肿瘤细胞株的SP细胞。人HT-29结肠癌细胞使用Hoechst33342染色，装有 375nm激光器的BD FACSAria Ⅲ上采集数据（左侧散点图）。作为对照样品， SP表达被抑制（右侧散点图。）
个人分选 精彩演绎
可靠的性能，小巧的机身，实惠的价格开启了细胞分选的新时代 三激光8参数检测
➢ 结合位点不同 ➢ 染色方法不同 ➢ 激发波长不同 PI在DNA检测中应用最广泛
DNA染色过程中一定不要洗涤
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DNA含量检测
• 细胞周期 • 细胞凋亡 • 染色体分选 • 肿瘤干细胞分选
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DNA含量检测
• 细胞周期
G2 M
细胞周期
s
DNA分析
G0
细
G1 胞
数 量
G0G1
s G2M
2N
200
488nm 520nm
荧光素分子利用激发光提供的能量激发荧光 分子的初级电子跃迁到激发态，然后返回基 态轨道释放能量（也就是发射光）。
异硫氰酸荧光素（FITC）
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流式细胞仪的检测信号-荧光
➢ 使用不同荧光标记的单克隆抗体染色，做多色分析 ➢ 荧光信号的强弱，反映了细胞抗原的表达含量 ➢ 常用的荧光素：PE，FITC，APC等
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BD FACSJazz配置及核心技术指标 （1）
光学系统
原厂预优化设置和直观的操作 最高可达三激光6色，488nm激光器标配， 405nm、561nm、640nm激光器选配 支持多种荧光染料 简化的光路调节
针孔摄像视频窗口
检测灵敏度：
FITC <125MESF； PE <125MESF
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BD FACSJazz配置及核心技术指标 （2）
保护设施： Baker定制生物安全柜，符合严格 的国际行业标准 同时保护样本、操作者和实验室 环境 完全符合生物安全标准 有效的气流控制
服务与支持
➢ 定期维护保养 ➢ 经验丰富的技术人员 ➢ 定期的用户交流会议 ➢ 各种形式及内容的小型专业讲座 ➢ 实际操作上机培训 ➢在线技术交流
向日葵、甘薯、木薯、猕猴桃、葡萄、棉花和李子的倍性鉴定。这将有利 于果树和农作物的培植和育种。
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细胞凋亡
➢ 凋亡后期，细胞膜通透性增大，DNA降解，降 解产生的DNA核小体片段从细胞中释放，因此， 凋亡细胞比活细胞含有更少的DNA。
➢ 凋亡细胞的DNA峰会出现在正常细胞G0/G1峰 之前，称为sub-G1峰。
BD流式分选的原理和应用
纲要
➢ 流式细胞仪的原理 ➢ 流式细胞仪的应用 ➢ BD FACSJazz个人型流式细胞分选仪
BD公司简介
Fairlegh S. Dickinson
Maxwell W. Becton
➢ 美国BD公司是由Maxwell W. Becton和Fairleigh S. Dickinson 于1897年在纽约 创立的，总部设在新泽西州。
➢ 细胞凋亡的PS与Annexin Ⅴ结合，呈Annexin Ⅴ阳性，同 时凋亡细胞的细胞膜是完整的，PI不能进入，因此，凋亡 细胞是Annexin Ⅴ+/PI-。
➢ 死细胞的PS与Annexin Ⅴ结合也呈阳性，但死细胞的膜已 经破裂，PI能够进入，所以死细胞是Annexin Ⅴ+/PI+。
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前向角散射光信号FSC
侧向角散射光信号SSC
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流式细胞仪的检测信号-荧光
➢激发光谱（Excitation，Ex）： ✓是指能特异性地激发某种荧光素的一定波长范围内的光线，也
称为吸收光谱。
✓吸收波峰（最大吸收波长）：Ex-Max ➢发射光谱（Emission，Em）：
✓是指某一波长激发光引起荧光素发射的一定波长范围内的荧光 ✓发射波峰（最大发射波长）：Em-Max
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转染绿色荧光蛋白GFP细胞的分选
分选后细胞在显微镜白光视野下可见， 细胞膜清晰， 状态很好， 在荧光显微镜 下GFP所发绿光清晰可见， 充分说明FACSAria III 分选低表达细胞的高纯度和高活 性。
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DNA含量检测
• 常用DNA染料：Hoechst33342、Hoechst33258、DAPI、色霉素A3 （CA3）、吖啶橙（AO）、碘化丙啶（PI）、7-AAD、DRAQ5、EB 等。
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细胞凋亡-Annexin Ⅴ/PI双标记法
➢ 细胞凋亡时会发生一系列形态学改变。质膜内侧的磷脂酰 丝氨酸（phosphatidylserine,PS）重新分布，由胞膜内 侧翻转到胞膜外侧，可以通过膜联蛋白Ⅴ（Annexin Ⅴ） 来检测。
➢ 为了区分凋亡和坏死两种不同情况下的PS外翻， Annexin Ⅴ常与鉴定细胞死活的染料（PI或7-AAD）联合使用。
400
4N DNA含量
600
8001000来自 28小鼠精原细胞倍性分析分选
本实验取小鼠睾丸细胞， 用Hochest33342进行染色， BD FACSAria SORP倍性分析 后分选其中的初级精母细胞（ 4N）， 分选出的初级精母细胞后续用来抽提RNA。
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小鼠精原细胞倍性分析分选
小鼠睾丸细胞倍性分析， 可清楚看到各倍体细胞群：N、 2N、 4N。本案例用BD FACSAria SORP的UV激光光进行Hochest33342染色的小鼠睾丸精原细胞倍体分析分 选， 从单参数直方图可见，单倍体（ N） 峰、 二倍体（ 2N） 峰、 四倍体（ 4N） 峰区分很开， 说明本实验检测精度高， CV值低。