生物膜

细菌生物膜的研究进展
在自然界、某些工业生产环境(如发酵工业和废水处理) 以及人和动物体内外,绝大多数细菌是附着在有生命或无生命物体的表面,以生物膜(biofilm, BF) 方式生长,而不是以浮游菌在物体表面形成的高度组织化的多细胞结构,同一(planktonic) 方式生长。

BF 是细菌株的BF 细菌和浮游生长细菌具有不同的特性。

虽然人类第一次借助显微镜观察到的是人牙菌斑BF 细菌,但多年来经典细菌学主要是研究浮游生长的细菌, 而忽视了对BF 细菌的研究〔1 ,2〕。

随着对细菌致病机制的深入了解,发现BF 细菌对抗生素和宿主免疫防御机制的抗性很强,从而导致严重的临床问题,尤其是慢性和难治的感染性疾病,因此,开始重视对BF 的研究。

20 世纪30 年代中期,Gib2 bons 和van Houte 等〔2〕对牙菌斑BF 细菌和龋病的关系做了大量研究,为深入了解BF 细菌在健康和疾病中的作用奠定了基础。

现在已知,细菌可在人体组织如牙齿、牙龈、皮肤、肺、尿道及其他器官的表面形成BF ,引起诸如牙周病、龋齿、慢性支气管炎、败血病、血栓性静脉炎、难治性肺部感染和心内膜炎等疾病。

在血液、组织液和淋巴液等体液中一般不形成BF。

但由于这些体液含有适合细菌生长的有机营养成分,因此,当体液中含有细菌时,这些细菌可在人体内人工医疗装置(如隐型眼镜、人工关节和心脏人工瓣膜) 等无生命物体的表面形成BF。

此外,BF 细菌还可污染与人类生活相关的设施,如空调系统、供水系统和食品加工设备等, 由此造成传染病的流行。

据估计,大约65 %人类细菌性感染是由BF 细菌引起的〔325〕。

BF 研究涉及微生物学、免疫学、分子生物学、材料科学和数学等多学科,其真正作为一个独立学科发展起来始于20 世纪70 年代末。

90 年代后,随着相关学科的发展及对BF 细菌在医学上重要性的认识,BF 研究得到迅速发展。

1990 年,蒙大拿州立大学建立了世界上第一个生物膜工程中心。

近几年,美国国立卫生研究所(NIH) 也为此投入大量研究资金〔3 ,4〕。

目前,国内外越来越多的学者从事BF 研究,以期了解BF 形成的分子机制、生理生化特点及其调控机理等,其目的为控制BF 的相关感染。

一、细菌生物膜的特点
细菌生物膜(BF) ,国内也有学者译为生物被膜,是指附着于有生命或无生命物体表面被细菌胞外大分子包裹的有组织的细菌群体〔1 ,2 ,6〕。

BF 中水份含量可高达97 %。

除了水和细菌外,BF 还可含有细菌分泌的大分子多聚物、吸附的营养物质和代谢产物及细菌裂解产物等。

因此,BF 中存在各种主要的生物大分子如蛋白质、多糖、DNA、RNA、肽聚糖、脂和磷脂等物质。

BF 多细胞结构的形成是一个动态过程,包括细菌起始粘附、BF 发展和成熟等阶段,BF 细菌在各阶段具有不同的生理生化特性。

(一) 细菌粘附:细菌对宿主表面的粘附是细菌在宿主体内形成BF 的第一步〔7〕。

这种粘附作用主要是细菌表面特定的粘附素蛋白(adhesin) 识别宿主表面受体(receptor) 的结果,因此具有选择性和特异性。

宿主组织表面的蛋白、糖蛋白和糖脂常可作为受体,而选择性地吸附特定种类的细菌。

细菌粘附于表面可免于被流体带到不利于其生长的环境,例如,生长在尿道中的大肠杆菌具有高度进化的表面结构,牢固地附着在尿道内,免于被尿液冲出体外。

细菌可很快发生粘附,例如,内氏放线菌(Actinomyces naeslundii) 对附着在羟基磷灰石小球上的酸性富含脯氨酸的蛋白粘附,约1 小时吸附即趋于饱和〔8〕。

在细菌粘附阶段,由于缺乏成熟的BF 结构保护,细菌的抗性不强,因此,抗菌药物的疗效相对较好。

(二) BF 的发展:细菌粘附到表面后,即调整其基因表达,在生长繁殖的同时分泌大量胞外多糖(ex2 opolysaccharide , EPS) 。

EPS 可粘结单个细菌而形成细菌团块,即微菌落(microcolony) 。

大量微菌落使BF 加厚,因此, EPS 分子的产生对BF 结构的发展十分重要〔1 ,6〕。

在此阶段,除观察到EPS 合成的增加外,也经常观察到细菌对抗生素抗性的提高。

另外,还伴有诸如增加对紫外线的抗性、遗传交换效率、降解大分子物质的能力以及增加二级代谢产物的产率等特性的改变。

这些变化是细菌为适应自然环境而采取的生存策略,但正是BF 细菌的这些特性导致了严重的临床问题。

(三) BF 的成熟:成熟的BF 形成高度有组织的结构,利用激光共聚焦显微镜(confocal scanning laser mi2 croscope ,CSLM) 观察到成熟BF 结构是不均匀
的,即具有不均质性(heterogeneity) ,它是由类似蘑菇形状的微菌落组成的,在这些微菌落之间围绕着输水通道,可以运送养料、酶、代谢产物和排出废物等〔9〕。

因此,有人将成熟的BF 内部结构比喻为原始的循环系统。

当细菌在增殖时可因菌种、营养、附着的表面和环境条件不同,形成疏松或致密以及厚薄不等的BF 结构。

在BF 成熟过程中,除了与上述EPS 的产生有关外,细菌的密度感应系统(quorum sensing system) 起重要作用〔10〕。

例如,铜绿假单胞菌( Pseudomonas aeruginosa) 的密度感应系统突变株,与野生菌株相比,其形成的BF 较薄,缺少复杂的结构,且抗性较差。

细菌密度感应系统是细菌通过监测其群体的细胞密度来调节其特定的基因表达,以保证BF 中营养物质的运输和废物的排出,避免细菌过度生长而造成空间和营养物质缺乏。

革兰阴性细菌的密度感应系统大多是利用N2酰基高丝氨酸内酯(N2acyl homoserine lactones , AHL) 作为信号分子,AHL 浓度随细菌密度的增加而上升,当AHL 达到一个阈值时,可与一种转录激活子结合而激活,AHL和转录激活子复合物进一步诱导靶基因的表达〔10〕。

成熟的BF 在内在的调节机制或在外部冲刷力等作用下可部分脱落,脱落的细菌又转变成浮游生长状态,可再粘附到合适的表面形成新的BF。

由于BF 的形成是一个动态过程,且结构上存在不均质性,因此,BF 中的细菌是在不同时间和空间发展的,其基因表达和生理活性也具有不均质性。

BF 垂直方向不同层面的细菌RNA 含量、呼吸活性和蛋白质合成均不同。

同时由于细菌所处微环境的pH 和氧化还原电位等不同,可使遗传学上一致的细菌个体表现不同的特性,如产生毒素不同可使BF 中一些细菌个体对宿主无危害,而另一些细菌则可能对宿主有致命威胁〔9〕。

因此,不均质性是细菌BF 的另一个重要特性, 也与细菌的抗性有关。

从理论上讲,BF 是细菌在表面生活时采取的生长方式,这是细菌的一种本能,任何细菌均可形成BF。

但是,当细菌发生遗传改变时,可影响其形成BF 的能力,并有可能影响其致病性。

有些细菌的毒力因子(如菌毛等) 与形成BF 能力有关,则其毒力强弱可影响其BF 的形成。

具体到某一菌株能否形成BF ,是与环境信号有关的。

环境信号包括营养成分、温度、渗透压、pH、铁离子浓度和氧化还原电位等,其中营养成分对BF 的形成起重要作用。

例如, 铜绿假单胞菌和荧光假单胞菌几
乎可在任何可以生长的条件下形成BF ,大肠杆菌( Escherichia coli) K212 和霍乱弧菌(Vibrio cholerae) 的一些菌株在基础培养基条件下不能形成BF ,但是, 大肠杆菌O517∶H7 只在低营养培养基条件下形成BF。

如菌株是由表面分离的,
一般该菌株具有形成BF 的能力。

不是由表面分离的菌株,可用微量反应板方法测定其形成BF 的能力,其基本步骤是在微量反应板的孔中培养细菌,形成的BF 将
贴附于孔壁,洗掉浮游细菌后,用结晶紫染色法观察是否形成BF。

BF 可由纯菌种形成,也可由多菌种组成。

在多菌种BF 中,不同菌种在不同的时间和空间发展,
存在着菌种的交替演变。

牙菌斑是典型的多菌种BF〔11〕,革兰阳性链球菌
( Streptococcus) 和放线菌是牙菌斑BF 中早期定植菌种,它们的粘附生长为后继定植菌种的粘附创造了新的粘附表面受体,例如,梭杆菌( Fusobacteri2 um)
可通过共凝集作用(coaggregation) 粘附到链球菌和放线菌上面。

另外,链球菌和放线菌的代谢造成局部微环境改变(氧化还原电位和pH 等) 也为新菌种的演
变创造了条件,例如,一些兼性厌氧菌的生长消耗氧气,从而创造了厌氧微环境,
使绝对厌氧梭杆菌有可能在口腔这一开放环境中得以定植生存。

因此,多菌种BF 扩大了细菌的生存环境。

二、生物膜细菌致病的机制
(一) 抗生素抗性:与浮游细菌相比,BF 细菌对抗生素的抗性可提高10～1 000 倍。

BF 细菌抗药性主要取决于其多细胞结构〔12 ,13〕:
(1)BF 中的EPS 起屏障作用,限制抗生素分子向细菌细胞运输。

多糖蛋白复合物还可与一些药物反应,具有中和药物的活性;
(2)BF中微环境的不同可影响抗生素的活性,如局部酸性代谢产物的积累对
许多抗生素活性有拮抗作用,厌氧微环境可严重影响氨基糖苷类抗生素的活性等。

此外, 营养的消耗或抑制性代谢产物的积累可使一些细菌生长缓慢或停止分裂,这类细菌一般对抗生素敏感性差。

因此,BF 结构的不均质性和BF 细菌生理上的不均质性使渗入的药物只能杀死一部分细菌,而另一部分细菌则存活下来;
(3) 表面生长可诱导细菌表达与浮游细菌不同的基因,诱导产生BF 特异性
表型。

例如BF 中的一部分细菌可进入一种类似芽孢菌的分化状态,其对抗生素有
高度抗性;
(4) 多菌种BF 中各菌种的协同作用。

例如,产生β2内酰胺酶的菌种可保护不产生此酶的菌种免受青霉素的作用。

(二) 对抗机体免疫防御:BF 细菌可利用多种方式对抗机体免疫防御机制〔14217〕:
(1) 减少细胞因子(cy2 tokine) 的产生或酶解细胞因子。

例如,表皮葡萄球菌( Staphylococcus epidermidis) 浮游细胞刺激人血淋巴细胞产生的γ干扰素量是BF 细胞的8～16 倍;
(2) 抵抗单核巨噬细胞的吞噬作用;
(3)BF 产生的粘液多糖可抑制中性粒细胞的趋化作用;
(4)BF 细菌可刺激机体产生抗体,但这些抗体不仅难以杀灭BF 内部的细菌,而且可在BF 表面形成免疫复合物,损伤周围的机体组织;
(5)BF 诱导的补体转化和中性粒细胞呼吸明显下降。

值得指出的是,一种BF 抗药或抗机体免疫防御的机制不是单一的,往往有多个机制共同起作用。

另外, 不同菌种的抗性机制也不尽相同。

三、生物膜相关感染的控制
常用抗生素疗法对细菌BF 引起的感染疗效欠佳。

随着细菌耐药因子的传播,传统抗生素的疗效更为有限。

在这种情况下,细菌BF 的研究为抗细菌性感染特别是难治性慢性感染提供了崭新的途径。

(一) 从细菌BF 中鉴定新的抗生素物质,发展新型抗生素类药物。

新药的设计目标是破坏BF 的形成, 因此,凡是与BF 的动态变化和结构形成有关的分子转化、代谢活性和信号传导过程,均可作为新药研制的目标〔18〕。

1999 年Schneewind 研究组〔19〕在革兰阳性菌金黄色葡萄球菌( S . aureus) 中发现了一种转肽酶( sor2 tase) ,它与表面蛋白的分泌定位有关。

该酶缺陷株不能正常表达表面蛋白,从而大大减弱诱变株对宿主的粘附性和致病性。

转肽酶基因几乎存在于所有革兰阳性细菌中〔20〕,因此,它是一种很有价值的新药目标,能抑制转肽酶形成的药物预计能有效预防革兰阳性细菌引起的感染。

EPS 和细菌密度
感应系统等均可作为筛选新药的目标,新药可干扰EPS 和AHL 信号的合成, 或降解已形成的EPS 和AHL 。

其特点是不杀死细菌, 而只是破坏细菌在宿主体内的粘附、定植和形成保护性的BF ,这样细菌发展抗药性的环境压力较弱,因此不易产生抗药性。

(二) 研究人体健康微生物BF 的组成及其与宿主和睦相处的分子机制,发展新型抗感染微生态制剂。

值得指出的是,并非所有BF 都是有害的,人体带有大量正常微生物,与人类健康息息相关。

新型抗感染微生态制剂将着眼于增进有益的正常微生物BF 活性,通过竞争营养、空间和产生微生物拮抗物质,特异性地抑制病原菌的粘附、定植和在生物膜中的代谢,克服由于传统抗生素的使用所引起的正常菌群失调、真菌二次感染和抗生素抗性等问题〔4〕。

目前,国内外开发的微生态制剂主要有三类:即益生菌(probiotics) ,如双歧杆菌和乳酸杆菌等;益生元(prebiotics) ,如双歧因子和各种寡聚糖等;合生元(synbiotics) ,即益生菌和益生元同时并用的生态制剂〔21〕。

(三) 发展抗细菌粘附的生物材料,预防BF 污染各种临床应用的导管、插管和医用合成材料。

表层镀银的合成材料可预防BF 污染心脏人工瓣膜和导尿管等〔22 ,23〕;表面镀钛的人工声带可防止假丝酵母( Candi2 da) 污染〔24〕。

(四) 对现已应用的抗生素,研究其尚未被发现的抗BF 特性和新药的治疗方案。

据报道,联合使用抗生素效果良好。

Yamasaki 等〔25〕发现罗红霉素和亚胺硫霉素合用能有效杀灭金黄色葡萄球菌BF ,其机制与增强多形核白细胞和巨噬细胞对BF 的渗透有关。

罗红霉素和氟罗沙星对铜绿假单胞菌BF 有明显抑制作用,两者合用可治疗由铜绿假单胞菌BF 引起的难治性感染, 其中罗红霉素通过抑制细菌多糖蛋白复合物合成来增强氟罗沙星对BF 的渗透,对氟罗沙星杀灭BF 中细菌起增效作用〔26〕。

目前应用的抗生素主要是通过测定其杀菌或抑菌活性筛选获得的,但有必要应用新的筛选标准,如抗细菌粘附等,重新判定已知抗生素的抗BF 活性。

总之,BF 的研究使微生物学的发展迈出了重要一步,即认识到微生物可以以多细胞的生命形式存在,具有比以往所理解的更为复杂的生命活动。

同时,这一领域的研究将大大丰富人类控制细菌性感染的手段。

当前,各种先进的生物
技术被用于BF 的研究,例如,利用激光共聚焦显微镜和原子力显微镜研究BF 的结构和动态变化;利用报告基因和荧光探针了解BF 中的基因表达;利用基因芯片和双向电泳技术比较BF 细菌和浮游细菌基因表达和蛋白组成的区别等。

可以预见, 随着BF 研究的深入,人类将能更好地控制细菌性感染。

黏液型铜绿假单胞菌生物膜形成的研究进展
铜绿假单胞菌（PA）是引起菌血症、泌尿系感染及多种慢性呼吸道疾病的重要病原菌，也是医院感染的主要病原菌之一。

根据菌落形态及是否产生大量藻酸盐，可将PA分为黏液型和非黏液型2个型别。

黏液型和非黏液型菌株表现出不同的致病性和抗菌药物耐药性，是目前细菌学中非常活跃的研究领域。

一、生物膜
生物膜（biofilm）是细菌为适应环境、利于生存，在黏附于生命或无生命物体表面时分泌的由多种多糖蛋白质的复合物，也被称作胞外基质；其可使细胞相互粘连，形成一种特殊细菌群体。

细菌的胞外基质具有复杂的功能，作为生物膜结构支架，有抵抗抗生素杀菌的作用。

多聚糖成分Psl和Pel为胞外基质主要成分，Psl富含甘露糖，Pel富含葡萄糖，两者在细菌生物膜的形成中起重要作用。

当细菌分泌过多Psl和Pel时，细菌表型将发生变异。

生物膜的形成是一个动态过程，包括可逆性黏附、不可逆性黏附、微菌落的形成、生物膜的形成和解聚几个阶段。

细菌配体和固相表面上的受体结合，细菌可逆性黏附于固相表面，当多个黏附的细菌聚合成菌落基底后，细菌的密度感应系统（QS）开始启动，细菌产生大量胞外基质，其与细菌黏结成微菌落。

随着QS 的不断作用，菌落厚度增加，此时细菌处于休眠状态，细菌生物膜进入成熟阶段。

二、黏液型PA与生物膜
1、黏液型PA的生物膜
黏液型PA与生物膜是由蘑菇样或柱样亚单位组成，亚基间连接紧密，不易破坏，导致细菌具有较强存活能力。

成熟生物膜蘑菇样顶端成分为鼠李糖，鼠李糖脂与成熟生物膜中的水通路有关。

与PA生物膜相关的QS系统是：LasRI和Rh1R1系统、PQS，三个系统相互联系。

黏液型PA比非黏液型PA更易形成生物膜，且厚度更大，这可能是其临床不易治愈的原因之一。

2、黏液型PA生物膜的耐药机制
PA的耐药机制主要包括：产生抗菌药物灭活酶或修饰酶；抗菌药物作用靶位的改变；细菌外膜对抗菌药物的屏障作用和/或主动外排；形成生物膜。

生物
膜形成介导的耐药性为黏液型PA较为特别的机制，其耐药机制如下：（1）弥散屏障：生物膜具有独特的三维结构，对抗菌药物有不同的渗透活性，阻挡抗菌药物向生物膜内的PA渗透，使进入细菌体内的药物浓度降低，作为保护屏障使PA 表现出耐药性；另外，胞外多糖中含有高浓度的抗菌药物水解酶，也可使抗菌药物失效。

（2）微环境梯度：生物膜中的营养成分、代谢产物浓度、渗透压和氧浓度等，由外向内呈梯度下降；生物膜内部的细菌处于“饥饿状态”，生长缓慢或停止，对药物的敏感性也下降；而残存的PA可利用死亡细菌作为营养源迅速繁殖形成新的生物膜。

（3）抵抗表型：生物膜产生后，细菌可表达一些特殊的、具有保护性的生物表型，从而导致耐药；有研究发现，成熟生物膜中PA的抗菌药物最低抑菌浓度比悬浮菌高1000～2000倍。

研究已表明，生物膜内细菌可分泌β-内酰胺酶水解头孢类抗生素，氨基苷类抗菌药物可与生物膜内细菌的外周多糖相互作用。

三、藻酸盐与mucA基因
藻酸盐是一种阴离子黏性多糖复合物，分为海藻藻酸盐与细菌藻酸盐。

细菌藻酸盐是一种乙酰化的线性多糖，以多聚古洛糖醛酸、多聚甘露糖醛酸及混合多聚物3种形式不同的比例存在于藻酸盐分子中。

藻酸盐是黏液型PA生物膜胞外多聚基质中的主要成分，也是PA生物膜的毒力因子，但藻酸盐的产生与生物膜的形态无关。

mucA基因是藻酸盐合成的最重要的负性条件基因，是造成PA发生黏液型转换的主要机制。

mucA基因编码的内膜蛋白MucA具有抗铜绿假单胞菌algU的作用，后者可直接影响藻酸盐的合成增加。

mucA基因突变导致MucA变化，失去抗algU的作用，使藻酸盐合成增加。

虽然mucA基因突变是PA产生黏液表型的重要因素，但非唯一因素，mucB、mucD、algT及algω等基因对调节藻酸盐合成也发挥作用。

四、黏液型与非黏液型PA
碳和氮均可以作为PA的能量来源，故PA在有氧和无氧环境中均能生存。

黏液型PA是PA的特殊自然表型，与非黏液型PA有所不同，其具备PA的基本生物
学特征，氧化酶阳性，临床经常用氧化酶试验鉴定黏液型PA与其他能形成黏液型菌落的细菌，如肺炎克雷伯细菌。

黏液型PA多分离于老年患者、反复慢性感染者，抗菌药物治疗效果极差，这与其产生多种毒力因子有关，如磷脂酶C、外毒素A、内毒素S、脂多糖。

黏液型与非黏液型PA可相互转变，但转变体血清型无明显差异。

临床检验中，黏液型PA的分离率远低于非黏液型；体外药物敏感试验中，非黏液型PA对抗菌药物的耐药率明显高于黏液型PA。

这主要是因为体外药敏试验只测试浮游状态的细菌，不能反映生物膜介导的耐药性，造成实验室检测和临床治疗效果之间的矛盾。

如PA对复方磺胺甲恶唑天然耐药，体外药物敏感试验发现，非黏液型PA符合这一规律，而黏液型PA有47%的菌株对其敏感。

因此，治疗黏液型PA时应注意生物膜产生的耐药性对治疗效果的影响，以免造成误判。

黏液型与非黏液型PA
PA 菌落性状藻酸盐mucA 黏附能力
体外对抗菌
药物耐药性
黏液型
无金属光泽
无特殊香味
量多
高2～6倍
突变
强
高10～100倍
弱
非黏液型
蓝绿色或黄绿色
生姜气味量少
未见
突变报道
弱
强
多药耐药率高
大环内酯类抗生素能抑制合成藻酸盐关键酶的活性，减少藻酸盐的合成。

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