微生物的分子生物学鉴定方法

微生物的分子生物学鉴定方法1

胡雪莲1，张钧1，单保庆2

1北京理工大学生命科学与技术学院，北京（100081）

2中国科学院生态研究中心环境水化学国家重点实验室，北京（100085）

E-mail: zhangjun@

摘要：传统的微生物分类和鉴定方法主要是以微生物的形态学和生理生化等特性为依据，繁琐且费时。近年分子生物学的发展，为微生物的分类鉴定工作提供了较简便准确的方法。分子生物学方法一部分用到PCR扩增，比如：变性和温度梯度凝胶电泳，单链构建多态性，限制性片段长度多态性，自动核糖体间隔基因分析等。一些不依赖PCR的方法也得到广泛的应用，如荧光原位杂交，DNA联合分析等。本文重点综述了几种广泛应用的分子生物学技术并对其原理及优缺点进行了阐述。

关键词：微生物群落，分类和鉴定，分子生物学方法

近15年人们对微生物多样性进行了大量的研究，但是由于技术方法的局限，一些研究并不能深入展开。分子生物学方法的出现使人类可以在种属水平上对水生真核微生物群体的多样性进行鉴定和分类，但是对原核微生物的研究仍然很少。因为它们体积微小，表型特征多样，而且大部分原核微生物不能人工培养，因此实际上也只有0.5%～10%的原核生物被鉴定出。令人欣喜的是近年来出现的一些分子生物学方法为我们研究原核微生物开辟了新途径。

在本文中，我们讨论了研究水生态环境中微生物多样性的分子生物学方法，其中简要介绍PCR技术,重点介绍基于PCR技术和不依赖PCR技术的方法。

1. PCR技术

PCR技术的兴起是生物科学界的重要变革,它克服了原有技术的不足,使人类对微生物的研究有了大的进展，由于高度的特异性和敏感性PCR扩增技术已成为研究微生物的有力工具。随着PCR技术的成熟一些更为先进和灵敏的方法应运而生,例如:实时荧光PCR(real time-PCR),反转录PCR(Reverse Transcription(RT)-PCR)，触减PCR(Touchdown-PCR),嵌套PCR （Nested-PCR）, 最小循环数PCR(Minimum Cycles for Detectable Products(MCDP)-PCR)等。其中实时荧光PCR（real time-PCR）可以定量测定微生物，此方法可以检测到扩增过程中任一时间反应物的变化 [1].它可用于测定提取总DNA中靶基因的含量。如果靶基因含量较高，扩增几个循环就能检测到产物。反转录PCR（RT-PCR）中，用特殊的引物扩增可以得到大量的目的片段。RT-PCR是一种非常灵敏的扩增活性基因的方法，它还可以测出活性较大的基因,并可以找到含有大量RNA的活性细胞[2]。在触减PCR (Touchdown-PCR)技术中,退火温度在每个连续的循环中持续降低1～2℃，退火的起始温度要比T m高5～10℃,以后逐渐降低。起始扩增循环要在很严格的退火条件下进行,以后的扩增条件逐渐宽松这样可扩增出大量产物。此方法可以达到最理想的扩增效果而不需耗费时间[3]。最小循环数PCR(MCDP-PCR)技术可以找出能检测到微量产物的最少循环数，因此可以把循环数减少到最小以使反应受到的干扰也最小。基因盒PCR(gene Cassette-PCR)技术靶向重组位点，因此内含子两侧的基因被用于探索环境基因群中的新基因。这种方法事先不需要知道基因的序列[4]。尽管PCR技术是检测微生物多样性的最快的方法之一，但它本身也有着局限性，比如不同DNA模板的多

1本课题得到天津市科技创新专项资金项目（06FZZDSH00900）的资助。

样化扩增，扩增对模板浓度的敏感性，对不纯DNA的扩增，嵌合序列的构建都影响PCR 的测定结果[5]。

2. 基于PCR的分子生物学方法

2.1 克隆文库中的随机测序

克隆文库中的随机测序(Random sequencing in clone libraries)，此方法的第一步是PCR产物的克隆，然后进行克隆文库的随机测序。序列分析可以鉴定出初始PCR产物中的优势拷贝，把这些序列与序列库中相似序列做比较，就可以对新序列进行鉴定或分析其与已知物种的关系，并可以通过构建系统发育树从分子序列库中推断出生物发育的关系。

克隆测序方法首先被Giovannoni 等[6]应用于16SrDNA的定位，以对海域中浮游细菌的多样性作检测。Zwart等[7]分析了北美和欧洲处于不同生长PH值和营养条件下的微生物的16SrDNA，结果表明淡水细菌在全球都有分布。

2.2 变性梯度凝胶电泳（DGGE）和温度梯度凝胶电泳（TGGE）

变性梯度凝胶电泳（Denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE)和温度梯度凝胶电泳（Temperature gradient gel electrophoresis，TGGE)问世已有十年之久，它们常用于微生物群体多样性的检测并监测其动力学变化。用这两种方法可以对生物多样性进行定性或者半定量测定。邢薇等[8]利用DGGE技术研究了产甲烷污泥颗粒中的真细菌和古生菌。DGGE和TGGE 分别通过逐渐增加的化学变性剂线性浓度梯度和线性温度梯度可以把长度相同但只有一个碱基不同的DNA片段分离。DNA分子的双链在特定温度下会分离，这个温度取决于互补链的氢键含量（富含GC的区域融解温度较高）和相邻碱基的引力。在进行凝胶电泳时，首先融解的区域会使整个分子的运动性减慢从而导致整个片段的断裂，从而改变分子的迁移率。两条单链由于GC夹板结构的存在而不能完全分离，GC夹板是引物与模板形成的，它可增加模板与引物的结合率从而增加扩增效率。DGGE和TGGE可以快速测定优势菌群。

DGGE/TGGE已广泛用于分析自然环境中细菌、蓝细菌, 古菌、微型真核生物、真核生物和病毒群落的生物多样性[8]。这一技术能够提供群落中优势种类信息并同时分析多个样品，具有可重复和操作简单等特点, 适合于调查种群的时空变化, 并且可通过对条带的序列分析或与特异性探针杂交分析鉴定群落组成。

2.3 单链构象多态性（SSCP）

单链构象多态性（Single-strand conformation polymorphism，SSCP)分析可以检测DNA序列之间的不同。SSCP首先由Lee 等[9]用于研究自然微生物群体的多样性。在低温条件下，单链DNA呈现一种由内部分子相互作用形成的三维构象，它影响了DNA在非变性凝胶中的迁移率。相同长度但不同核苷酸序列的DNA由于在凝胶中的不同迁移率而被分离。迁移率不同的条带可被银染或者荧光标记引物检测，然后用DNA自动测序进行分析。

用PCR-SSCP技术可以进行序列差异的测定，而敏感度会随着片段长度的增加而降低。但是只要条带被凝胶电泳分离开就可以进行系统发育的研究。在Schmalenberger 和Tebbe[10]的研究中，测序技术表明一个单链也许包括多种序列，电泳条件也会因此影响基因结构的确定进而影响生物多样性的研究。

2.4 末端限制性片段长度多态性（T-RFLP)