一种高效实现多片段插入的重组质粒的构建方法

高效构建一种多片段插入的疟原虫基因敲除重组质粒

刘权兴谭章平徐文岳戴纪刚

【摘要】目的构建一种基因敲除重组质粒，在PL0007质粒中实现多个片段的无缝插入。方法首先，设计融合PCR引物，在各片段之间的引物设计15bp重叠序列，并且在第一个插入片段的5’端和最后一个插入片段的3’端也要与载体上重叠15bp。其次，运用常规PCR 方法扩增出待融合片段，并进行胶回收纯化。应用融合PCR技术将要插入的各个片段拼接到一起成为一个大片段。最后，应用无缝克隆试剂盒将该大片段插入PL0007质粒的特定位点。结果经酶切鉴定和DNA测序证明所构建的重组质粒完全正确，插入序列碱基无一突变。结论联合应用融合PCR技术和无缝拼接技术可以高效的在质粒载体中连续无缝插入多个片段，阳性率比传统技术更高，操作更方便。

[关键词]：重组质粒、融合PCR、无缝拼接

[中图分类号] R382.3+1

A highly efficient method for the construction of recombinant plasmid

with several DNA fragments insertion for knockout Plasmodium genome [Abstarct]Objective In this study, we describe a general method for plasmid assembly that uses infusion method to insert three DNA fragments into plasmid PL0007. Methods At first, we designed the fusion PCR primers, which request 15bp overlap sequence between the primers, and the first insertion fragment of the 5' terminal and the last insertion fragment of the 3' terminal also overlap 15bp with the vector. Secondly, infusion fragments, amplified by PCR and purified with the Gel Extraction Kit, were infused into a integrated fragment with the method of fusion PCR technology and then inserted into the target site in the plasmid PL0007 with the Infusion Kit. At last, the recombinant plasmid was proved entirely correct with no mutation in the sequence of bases by restriction enzyme digestion and DNA sequencing. Results Restriction endonuclease reactions was used to identify the recombinant plasmid and followed by sequence analysis. All recombinant plasmid are right and without a mutation point in the inserted fragment. Conclusion Combined with fusion PCR technology and fusion PCR technology may insert mμl tiple fragments into plasmid vectors with high efficacy and more convenient, and the positive rate is higher than the traditional technology.

[Key words] recombinant plasmid; infusion PCR reactions; homologous recombination

随着基因测序技术的日益成熟，多种生物的全基因组测序已经完成，功能基因组学已成为时下研究的热点[1]。构建重组质粒在细胞中插入某些基因使其表达及进行基因敲除是研究基因功能的重要方法[2]。然而传统的酶切连接的方法只对于质粒中单片段的插入较为合适，当涉及到要在质粒中连续插入多个片段时往往需要设计多个酶切位点，并且不可避免地在片段与片段之间引入无关酶切位点，这可能会影响插入片段的表达。有时还会因找不到合适的酶切位点而无法构建出目的重组质粒。为了克服传统方法的缺陷出现了以聚合酶链反应为基1础的实现多片段拼接的技术即融合PCR技术，在质粒构建方面也出现了基于同源序列同源重组反应的无缝克隆技术。融合PCR技术[3-5]在无需限制性内切酶和连接酶的情况下，通过具有同源互补序列的引物将各需要拼接的片段单独扩增出来，同时以两单独片段共同作为模版，再加入首尾两端的引物再进行一轮PCR即可将任意两片段实现无缝拼接。这种技术只适用于构建一些线性化的DNA片段，无法实现重组质粒的构建。无缝克隆技术[5, 6]是指通过在设计插入片段引物时在5’端引入载体上的一段同源序列扩增出与载体有一定(15bp)同源序列的插入片段，进而通过重组酶的作用将插入片段无缝拼接入载体质粒中。理论上该方法可以实现单片段和多片段拼接，但在实际应用中发现单片段拼接时效率较高，随着拼接片段数量的增加同源重组效率会大大降低，有时很难得到阳性结果。

鉴于目前多片段重组质粒构建普遍存在的问题，本研究对联合运用融合PCR技术和无缝克隆技术构建多片段重组质粒的方法进行了探索。成功构建了三片段同时插入PL0007质粒的一种基因敲除重组质粒。并对多片段融合与无缝克隆的操作步骤、反应条件、技术要点进行了详细地论述。

与普通PCR反应相比，本实验的融合PCR反应改进了引物浓度，模版浓度，延伸时间等条件。本实验以构建伯氏疟原虫基因敲除及替换重组质粒为例。在PL0007质粒中插入敲除序列5’UTR和3’UTR，以及表达序列mouseMAGE-A3、gfp-3’pbdhfr/ts。（如图1）

1、材料与方法：

1作者简介：刘权兴，硕士研究生，主要从事肺癌的基础和临床研究。

通讯作者：戴纪刚，新桥医院胸外科副主任医师，E-mail: 691057831@

基金资助：国家自然科学基金面上项目(项目批准号:81172238)