CD2相关蛋白在足细胞分化中的作用

生理学报 Acta Physiologica Sinica , February 25, 2008, 60(1): 135-142
1402.5 敲低CD2AP 对足细胞分化的影响2.5.1 转染荧光图和流式图
转染CD2AP siRNA 24 h 后,荧光显微镜下可见细胞内散在分布的点状绿色荧光,流式细胞仪检测其转染效率约为66.27% (图5)。2.5.2 转染siRNA 后CD2AP 的表达
以GAPDH 为内参,计算机定量分析显示:转染siRNA 后48 h CD2AP mRNA 的表达较对照组下降了约57%,CD2AP 蛋白的表达较对照组下降了约39% (图6)。
2.5.3 转染siRNA 对细胞增殖的影响
转染siRNA 后第3天细胞计数,对照组细胞数
为(7.85±0.46)×105
个,转染组细胞数为(4.24±0.35)×105个,后者约为前者的54%。第7天计数,对照组细胞数为(3.61±0.22)×106个,转染组细胞数为(2.76±0.28)×106个,后者约为前者的76%。转染siRNA 对细胞增殖影响显著 (P <0.05)。2.5.4 分化标志物synaptopodin 的表达
经DNase I 去除RNA 中微量基因组DNA 的干扰后,足细胞分化标志分子synaptopodin 在33 ºC 许
图 7. Synaptopodin mRNA 表达
Fig. 7. mRNA expression of synaptopodin in undifferentiated,differentiated and siRNA-transfeced podocytes. M: marker; lanes 1, 2: podocytes under 37 ºC non-permissive condition for 1 week and 2 weeks, respectively; lanes 3, 4: podocytes under 33 ºC permissive condition for 1 week and 2 weeks, respectively; lanes 5, 6: siRNA-transfected podocytes under 37 ºC non-permissive condition for 1 week and 2 weeks, respectively. *P <0.05 vs lane 1. mean±SD, n =6.
图 6. CD2AP siRNA 转染足细胞48 h 后CD2AP mRNA 及蛋白的表达
Fig. 6. CD2AP mRNA and protein expressions in transfected podocytes at 48 h after siRNA transfection (RT-PCR, Western blot). A : mRNA expressions of GAPDH (357 bp) and CD2AP (504 bp). B : Protein expressions of GAPDH (36 kDa) and CD2AP (80 kDa). C : Statistical analysis. C: control group; T: transfected group. *P <0.05 vs control. mean±SD, n =6.
图 5. CD2AP siRNA 转染荧光图及转染效率流式图
Fig. 5. Transfected podocytes with specific CD2AP siRNA (m). A : Negative control. Scale bar, 10 μm. B : siRNA transfected podocytes.Scale bar, 10 μm. C
: The siRNA transfection efficiency determined by flow cytometer.

141姜华军等:CD2相关蛋白在足细胞分化中的作用
可条件下培养1周及2周的未分化足细胞中表达不明显或微弱;在37 ºC非许可条件培养下,随着足细胞的分化其表达逐渐增高。转染CD2AP siRNA 37ºC分化1周后,synaptopodin的表达较未转染分化组明显偏低;转染CD2AP siRNA 37 ºC分化2周后,synaptopodin的表达基本恢复(图7)。
3 讨论
体内足细胞是在肾脏发育过程中由间充质细胞向上皮细胞转化而来,并在肾小球毛细血管袢形成阶段开始分化形成足突,启动终末分化表型的表达[5]。足突间的SD是由多种蛋白构成的精细而复杂的结构,某些蛋白表达或分布异常可导致足突融合和足细胞脱落[9]。因此,深入了解足细胞的分化特点及相关结构蛋白在足细胞分化过程中的表达分布变化,有助于深入了解SD相关蛋白的生理功能及其在肾脏疾病发生、发展中的病理生理作用。本研究观察到,在足细胞分化过程中,细胞增殖速度明显减慢,随着足突的形成,细胞内结构蛋白发生分子重排。CD2AP与F-actin及nephrin在细胞内的分布存在共定位关系,CD2AP可能参与了细胞分化的过程。
在发育成熟的肾脏,足细胞是处于生长停滞、没有增殖能力的高度分化的终末细胞。H-2K b-tsA58转基因小鼠体内导入了温度敏感的tsA58永生化基因,后者受γ-IFN诱导的H-2K b启动子的调控[6]。本研究采用了这种转基因小鼠建立的足细胞系,是目前被普遍接受的、较接近体内足细胞生理特性的细胞系。在许可条件下,即33 ºC有γ-IFN时,细胞具有无限增殖的特性;在非许可条件下,即37ºC无γ-IFN存在时,细胞失去增殖能力而趋于分化成熟。本研究中我们观察到足细胞分化中的形态改变,即未分化时细胞呈“鹅卵石”状和分化中足突形成,细胞呈“树枝”状。W T1是W i l ms瘤抑癌基因,在成熟的肾组织特异表达于足细胞,是足细胞的标志蛋白[10]。Nephrin是首个被发现的存在于SD的足细胞特异性蛋白[11]。我们在分化及未分化足细胞中均检测到这些基因的稳定表达,验证了该细胞系的可靠性。
足突的形成必然伴随胞内结构蛋白和细胞骨架的改变[12],本研究中观察到 CD2AP、F-actin和微管蛋白在足细胞分化、足突形成时的表达及分布发生了明显改变。有研究证实nephrin参与了足细胞分化和SD构成[13]。CD2AP是近年来发现的存在于足突的SD相关蛋白[2],有研究者在小鼠皮质集合管上皮细胞中发现其直接与F-actin相互连接[3],但其在足细胞中与F-actin的共定位情况尚未明确。为此,我们观察了CD2AP、nephrin和F-actin在足细胞分化中的表达及分布。RT-PCR和Western blot结果表明,CD2AP和nephrin的表达在足细胞分化中出现不同程度上调。共聚焦显微镜观察到,CD2AP在未分化足细胞主要分布在核周及细胞主要突起的近核部,在分化的足细胞,CD2AP向细胞周边聚集,次级足突染色明显,这与nephrin的表达模式基本相同[13]。我们也检测到CD2AP和nephrin之间存在共定位关系,提示两者可能存在相互作用。同时,我们还观察了细胞骨架成分在足细胞分化中的变化及其与CD2AP的关系。结果发现,在未分化足细胞F-actin主要沿细胞长轴平行分布;在分化的足细胞,F-actin蛋白丝呈放射状延伸到细胞新形成的足突中,与以往的报道基本一致[8,13]。另外,F-actin 和CD2AP在细胞内的分布存在很大的重叠,两者的共定位关系比较明显以上。以上结果提示在足细胞分化过程中,CD2AP可能与SD分子和细胞骨架成分存在直接或间接相互作用,参与调节足细胞的分化过程。
为了进一步证实CD2AP在足细胞分化中的作用,我们采用抑制CD2AP基因表达的siRNA,其含有3对针对CD2AP mRNA不同靶位点的特异性siRNA系列,能特异抑制CD2AP基因的表达,已被其他研究者采用,效果显著[14]。在CD2AP siRNA 转染后48 h,我们用RT-PCR和Western blot检测到CD2AP mRNA和蛋白表达分别下降了57%和39%,作用明显。非许可条件下足细胞的增殖速度间接反映了足细胞分化的程度[8,12,15],此外,actin 相关蛋白—— synaptopodin已广泛应用于足细胞分化程度的判定[16,17]。 Synaptopodin在分化中的足细胞出现足突时才特异性表达,而在未分化的足细胞中不表达,这在以往的研究和本研究中均得到了证实[8,17]。本研究发现,siRNA敲低CD2AP表达后,细胞增殖速度明显减慢;分化1周后,synaptopodin的表达明显低于未转染对照组。表明敲低CD2AP基因迟滞了部分足细胞的分化。我们还观察到,分化2周后转染组和对照组synaptopodin的表达无明显差异,这可能与瞬间转染siRNA的一过性抑制作用相关。
本研究表明,在足细胞分化的过程中,细胞增