植物的抗寒性检测
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六、同工酶带相对迁移率计算
研究表明，过氧化物同工酶与植物抗寒性的关 系极为密切，抗寒性强的品种的同工酶带，一 般比抗寒性差的品种多 1～3 条，且随着温度 下降变化缓慢。
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注意事项
• 密封条要封好，不能漏水； • 灌胶时用移液管，可以慢一点，并水平移动， 防止凝胶不均匀，凝胶不会很快凝固，所以 不用担心； • 灌胶时不能有气泡产生，否则会影响后面凝 胶的效果。
植物的抗寒性检测
主讲人员： 小组代号： 小组成员：
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实验主要内容
1
实验背景
实验目的 实验原理 实验步骤
2
3 4 5
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注意事项
实验背景
我国植物种类繁多，分 布区域广，在晚秋和早 春时期发生的冻害和冷 害两种低温危害， 常常给越冬作物和果木 造成严重伤害。冻害由 0℃以下低温造成，冷害 由 0℃以上低温引起， 冷害对植物的伤害程度 ，除取决于低温外，还 取决于低温维持时间的 长短。
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二、贮液的配制
• A．30%Acr－0.8%Bis 贮液 • B．1M Tris-HCl 缓冲液（pH 值 8.8） • C．1M Tris-HCl 缓冲液（pH6.8）
• D．电极缓冲液
• E．1%过硫酸铵溶液 • F．溴酚蓝溶液
贮液的详细配制
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E．1%过硫酸铵溶液：称 0.5g 过硫酸铵溶 于 50ml 重蒸水中，放入 0～4℃冰箱，可保 存一周。 F．溴酚蓝溶液：称 0.2g 溴酚兰溶于 100ml 重蒸水中，配成 0.2%。
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A．30%Acr－0.8%Bis 贮液：称取 30gAcr 和 0.8gBis，用 50ml 重蒸水加热 溶解，将溶液用定性滤纸过滤到 100ml 容量 瓶内，定容后盛于棕色瓶中，于 0-4℃冰箱中 保存。 B．1M Tris-HCl 缓冲液（pH 值 8.8）： 称取 121.14gTris 用重蒸水溶解后倒入 1000ml容量瓶中，用浓盐酸调 pH 值至 8.8，最终加水定容至 1000ml，然后用滤纸 过滤，盛于棕色瓶中，放入 0～4℃冰箱保存。
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B．染色配比 ①：②：③：④：⑤＝20：2：5：8：5 C．染色 将配好的染色液倒入白瓷盘内凝胶板上， 37℃ 保温 30min，酶带呈紫红色。取出漂洗后， 7%醋酸中保存。 过氧化物酶同工酶显色 2～3d 更为清楚，在 暗室用透光照相的方法效果较好。也可用 280mm 波长下用光密度计扫描定量。
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表 5－ 4
不同配量及凝胶浓度所需贮液（ml）
贮液 10ml 3% 30%Acr－0.8%Bis 1.0 4% 1.3 20ml 3% 2.0 4% 2.6
1M Tris-HCl pH6.8
重蒸水 1%过硫酸铵 TEMED（为μl）
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五、染色
将脱下的凝胶，用去离子水冲洗凝胶板后，放 入长方型白瓷盘中染色。 A．染色贮液配制 ① 0.2M 醋酸钠溶液：称 2.8g 醋酸钠溶于 100ml 重蒸水中。 ② 5mM 硫酸锰溶液：称取 0.168g 硫酸锰， 溶于 200ml 重蒸水中。 ③ 联苯胺溶液：称 0.5g 联苯胺，溶于 10%冰醋酸 250ml 中。 ④ 愈创木酚溶液：称 1.35g 愈创木酚，溶于 250ml10%醋酸中。 以上四种溶液放冰箱中长期备用。 ⑤ 0.12%H2O2：凝胶洗出后才加。随配随 用。
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四、电泳
加样毕，注电极缓冲液入上、下电泳槽，在上 槽中加入一滴溴酚蓝。接通电源，上槽为负 极，下槽为正极。调节电流为 2 毫安/厘米 （2 毫安/管），在冰箱内进行。待溴酚蓝迁 移至下端约 0.5～1cm 处停止电泳，约 2h。
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1.0
7.7 0.3 15
1.3
7.1 0.3 15
2.0
15.4 0.6 30
2.6
14.2 0.6 30
③加样 装置好垂直板电泳槽，用 1%热琼脂封好缝隙。 样品制备：每克鲜样加 3.0ml 0.1mol/L 的 磷酸缓冲液（pH＝7.0），研磨，用纱布粗过 滤。 滤液离心：4000r/min，（0±2）℃，取 上 清液作供试酶液。 用 10 伏/厘米预电泳三分钟后，用微量进样 器吸取样品液分别每管加入 50 微升。
植物抗寒性的强 弱决定其生长季节，因此 蔬菜作物利用抗寒品种， 可以将露地栽培提前，提 早供应市场；而 选育抗寒性强的果树品种 ，不仅是寒带果树育种者 的主攻方向，而且也是温 带甚至热带果树 育种者重要育种目标之一 。
本实验重点学习实验室间接鉴定植物抗寒性的检测方法。
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实验目的
1、了解植物的抗寒性机制并掌握实验室间 接鉴定抗寒性的检测方法。 2、掌握用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳技术 Your Text here Your Text here Your Text here 分离 POD 同工酶的原理和技术。
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实验原理
实验室间接鉴定就是根据作物某些生理生化 指标及物理指标间接推断供试材料的抗寒性。 在一定低温范围内，植物体内自由基的产生 和清除之间基本上可以保持平衡。当温度持续 下降时，活性氧自由基就会明显增加，清除剂 含量降低，导致自由基积累，造成膜脂氧化。 生理生化指标主要包括超氧物歧化酶（SOD）、 过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）活性 测定及同工酶分析、丙二醛（MDA）及可溶性糖 含量等方法。
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②隔层胶的配制 按表 5－4 进行隔层胶的配制，用刻度吸管准 确吸取 30%Acr－0.8%Bis 和 1M TrisHCl（pH6.8）于抽滤瓶中，用电动吸引器减 压抽气，与此同时，吸去分离胶上层的水层， 抽气毕，加入 1%过硫酸铵溶液和TEMED， 立即灌注隔层胶（凝胶板需要迅速加入蓖子） ，其中加一水层，约 1h 可聚合好。
三、凝胶板的制备
①分离胶的制备 分离胶浓度多为 7%，按照表 5－3 进行 配制。先用刻度吸管准确地吸取 30%Acr－ 0.8%Bis 和 1M Tris-HCl（pH8.8）于抽 滤瓶中，用电动吸引器减压抽气，除去溶液中 气泡，抽气毕，再加入 1%过硫酸铵溶液和 TEMED，摇匀后，小心地将凝胶加入凝胶板 模具内，上面加一水层，在 25～30℃的地方 进行聚胶，约 1h。
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C．1M Tris-HCl 缓冲液（pH6.8）：称 12.114gTris 用重蒸水溶解后倒入 100ml 容量瓶中，用浓盐酸调 pH 值至 6.8，最终加水定容至 100ml，然后用滤纸 过滤，盛于棕色瓶中，放入 0～4℃冰箱保存。 D．电极缓冲液：称取 141.1g 甘氨酸和 30g Tris 用重蒸水加热溶解后倒入 1000ml 容量瓶中，加水定容至 1000ml。 用时稀释 20 倍，调 pH 值至 8.3。
实验步骤
1、材料处理
2、贮液的配制
6、同工酶带 相对迁移率计 算
实验步骤
3、凝胶板的制备
5、染色
4、电泳
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一、材料处理
植物枝条（花朵），将采回的枝条剪成 40cm 左右的长度，用自来水冲洗数遍（洗 掉泥土、灰尘），再用蒸馏水冲洗三次，然 后用吸水纸吸干水分，最后将枝条末端进行 蜡封。将每个品种蜡封后的枝条分成相等的 6 份，其中一份作为对照，其余每份作为一 个低温处理，放于冰箱中（0℃～4℃）保存 备用。每次处理时，各取参试品种的一份枝 条放于超低温冰箱低温处理，处理温度梯度 为：CK（0℃），-20℃，-25℃，-30℃，35℃，-40℃。降温速度为 4℃/h，达到目 的处理温度后维持 12h，然后逐步升温，升 温速度亦为 4℃/h。花朵的处理温度梯度为： CK（0℃），-1℃，-3℃，-5℃，-6℃，7℃，-8℃。
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实验原理
本实验采用同工酶分析测定法。
同工酶带相对迁移率计算：
Rf＝ 酶带迁移距离/溴酚蓝迁移距离 研究表明，过氧化物同工酶与植物抗寒性的关 系极为密切，抗寒性强的品种的同工酶带一般 比抗寒性差的品种多 1～3 条，且随着温度下 降变化缓慢。
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表 5－ 3
不同配量及凝胶浓度所需贮液（ml） 贮液 20ml 5% 30%Acr－0.8%Bis 1M Tris-HCl pH8.8 1%过硫酸铵 TEMED（为μl） 3.2 16.3 0.5 20 7% 4.5 15.0 0.5 20 10% 6.5 13.0 0.5 20 30ml 5% 4.9 24.3 40 40 7% 6.8 22.4 0.8 40 10% 9.7 19.5 0.8 40
六、同工酶带相对迁移率计算
研究表明，过氧化物同工酶与植物抗寒性的关 系极为密切，抗寒性强的品种的同工酶带，一 般比抗寒性差的品种多 1～3 条，且随着温度 下降变化缓慢。
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注意事项
• 密封条要封好，不能漏水； • 灌胶时用移液管，可以慢一点，并水平移动， 防止凝胶不均匀，凝胶不会很快凝固，所以 不用担心； • 灌胶时不能有气泡产生，否则会影响后面凝 胶的效果。
植物的抗寒性检测
主讲人员： 小组代号： 小组成员：
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实验主要内容
1
实验背景
实验目的 实验原理 实验步骤
2
3 4 5
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注意事项
实验背景
我国植物种类繁多，分 布区域广，在晚秋和早 春时期发生的冻害和冷 害两种低温危害， 常常给越冬作物和果木 造成严重伤害。冻害由 0℃以下低温造成，冷害 由 0℃以上低温引起， 冷害对植物的伤害程度 ，除取决于低温外，还 取决于低温维持时间的 长短。
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二、贮液的配制
• A．30%Acr－0.8%Bis 贮液 • B．1M Tris-HCl 缓冲液（pH 值 8.8） • C．1M Tris-HCl 缓冲液（pH6.8）
• D．电极缓冲液
• E．1%过硫酸铵溶液 • F．溴酚蓝溶液
贮液的详细配制
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E．1%过硫酸铵溶液：称 0.5g 过硫酸铵溶 于 50ml 重蒸水中，放入 0～4℃冰箱，可保 存一周。 F．溴酚蓝溶液：称 0.2g 溴酚兰溶于 100ml 重蒸水中，配成 0.2%。
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A．30%Acr－0.8%Bis 贮液：称取 30gAcr 和 0.8gBis，用 50ml 重蒸水加热 溶解，将溶液用定性滤纸过滤到 100ml 容量 瓶内，定容后盛于棕色瓶中，于 0-4℃冰箱中 保存。 B．1M Tris-HCl 缓冲液（pH 值 8.8）： 称取 121.14gTris 用重蒸水溶解后倒入 1000ml容量瓶中，用浓盐酸调 pH 值至 8.8，最终加水定容至 1000ml，然后用滤纸 过滤，盛于棕色瓶中，放入 0～4℃冰箱保存。
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B．染色配比 ①：②：③：④：⑤＝20：2：5：8：5 C．染色 将配好的染色液倒入白瓷盘内凝胶板上， 37℃ 保温 30min，酶带呈紫红色。取出漂洗后， 7%醋酸中保存。 过氧化物酶同工酶显色 2～3d 更为清楚，在 暗室用透光照相的方法效果较好。也可用 280mm 波长下用光密度计扫描定量。
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表 5－ 4
不同配量及凝胶浓度所需贮液（ml）
贮液 10ml 3% 30%Acr－0.8%Bis 1.0 4% 1.3 20ml 3% 2.0 4% 2.6
1M Tris-HCl pH6.8
重蒸水 1%过硫酸铵 TEMED（为μl）
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五、染色
将脱下的凝胶，用去离子水冲洗凝胶板后，放 入长方型白瓷盘中染色。 A．染色贮液配制 ① 0.2M 醋酸钠溶液：称 2.8g 醋酸钠溶于 100ml 重蒸水中。 ② 5mM 硫酸锰溶液：称取 0.168g 硫酸锰， 溶于 200ml 重蒸水中。 ③ 联苯胺溶液：称 0.5g 联苯胺，溶于 10%冰醋酸 250ml 中。 ④ 愈创木酚溶液：称 1.35g 愈创木酚，溶于 250ml10%醋酸中。 以上四种溶液放冰箱中长期备用。 ⑤ 0.12%H2O2：凝胶洗出后才加。随配随 用。
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四、电泳
加样毕，注电极缓冲液入上、下电泳槽，在上 槽中加入一滴溴酚蓝。接通电源，上槽为负 极，下槽为正极。调节电流为 2 毫安/厘米 （2 毫安/管），在冰箱内进行。待溴酚蓝迁 移至下端约 0.5～1cm 处停止电泳，约 2h。
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1.0
7.7 0.3 15
1.3
7.1 0.3 15
2.0
15.4 0.6 30
2.6
14.2 0.6 30
③加样 装置好垂直板电泳槽，用 1%热琼脂封好缝隙。 样品制备：每克鲜样加 3.0ml 0.1mol/L 的 磷酸缓冲液（pH＝7.0），研磨，用纱布粗过 滤。 滤液离心：4000r/min，（0±2）℃，取 上 清液作供试酶液。 用 10 伏/厘米预电泳三分钟后，用微量进样 器吸取样品液分别每管加入 50 微升。
植物抗寒性的强 弱决定其生长季节，因此 蔬菜作物利用抗寒品种， 可以将露地栽培提前，提 早供应市场；而 选育抗寒性强的果树品种 ，不仅是寒带果树育种者 的主攻方向，而且也是温 带甚至热带果树 育种者重要育种目标之一 。
本实验重点学习实验室间接鉴定植物抗寒性的检测方法。
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实验目的
1、了解植物的抗寒性机制并掌握实验室间 接鉴定抗寒性的检测方法。 2、掌握用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳技术 Your Text here Your Text here Your Text here 分离 POD 同工酶的原理和技术。
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实验原理
实验室间接鉴定就是根据作物某些生理生化 指标及物理指标间接推断供试材料的抗寒性。 在一定低温范围内，植物体内自由基的产生 和清除之间基本上可以保持平衡。当温度持续 下降时，活性氧自由基就会明显增加，清除剂 含量降低，导致自由基积累，造成膜脂氧化。 生理生化指标主要包括超氧物歧化酶（SOD）、 过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）活性 测定及同工酶分析、丙二醛（MDA）及可溶性糖 含量等方法。
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②隔层胶的配制 按表 5－4 进行隔层胶的配制，用刻度吸管准 确吸取 30%Acr－0.8%Bis 和 1M TrisHCl（pH6.8）于抽滤瓶中，用电动吸引器减 压抽气，与此同时，吸去分离胶上层的水层， 抽气毕，加入 1%过硫酸铵溶液和TEMED， 立即灌注隔层胶（凝胶板需要迅速加入蓖子） ，其中加一水层，约 1h 可聚合好。
三、凝胶板的制备
①分离胶的制备 分离胶浓度多为 7%，按照表 5－3 进行 配制。先用刻度吸管准确地吸取 30%Acr－ 0.8%Bis 和 1M Tris-HCl（pH8.8）于抽 滤瓶中，用电动吸引器减压抽气，除去溶液中 气泡，抽气毕，再加入 1%过硫酸铵溶液和 TEMED，摇匀后，小心地将凝胶加入凝胶板 模具内，上面加一水层，在 25～30℃的地方 进行聚胶，约 1h。
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C．1M Tris-HCl 缓冲液（pH6.8）：称 12.114gTris 用重蒸水溶解后倒入 100ml 容量瓶中，用浓盐酸调 pH 值至 6.8，最终加水定容至 100ml，然后用滤纸 过滤，盛于棕色瓶中，放入 0～4℃冰箱保存。 D．电极缓冲液：称取 141.1g 甘氨酸和 30g Tris 用重蒸水加热溶解后倒入 1000ml 容量瓶中，加水定容至 1000ml。 用时稀释 20 倍，调 pH 值至 8.3。
实验步骤
1、材料处理
2、贮液的配制
6、同工酶带 相对迁移率计 算
实验步骤
3、凝胶板的制备
5、染色
4、电泳
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一、材料处理
植物枝条（花朵），将采回的枝条剪成 40cm 左右的长度，用自来水冲洗数遍（洗 掉泥土、灰尘），再用蒸馏水冲洗三次，然 后用吸水纸吸干水分，最后将枝条末端进行 蜡封。将每个品种蜡封后的枝条分成相等的 6 份，其中一份作为对照，其余每份作为一 个低温处理，放于冰箱中（0℃～4℃）保存 备用。每次处理时，各取参试品种的一份枝 条放于超低温冰箱低温处理，处理温度梯度 为：CK（0℃），-20℃，-25℃，-30℃，35℃，-40℃。降温速度为 4℃/h，达到目 的处理温度后维持 12h，然后逐步升温，升 温速度亦为 4℃/h。花朵的处理温度梯度为： CK（0℃），-1℃，-3℃，-5℃，-6℃，7℃，-8℃。
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实验原理
本实验采用同工酶分析测定法。
同工酶带相对迁移率计算：
Rf＝ 酶带迁移距离/溴酚蓝迁移距离 研究表明，过氧化物同工酶与植物抗寒性的关 系极为密切，抗寒性强的品种的同工酶带一般 比抗寒性差的品种多 1～3 条，且随着温度下 降变化缓慢。
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表 5－ 3
不同配量及凝胶浓度所需贮液（ml） 贮液 20ml 5% 30%Acr－0.8%Bis 1M Tris-HCl pH8.8 1%过硫酸铵 TEMED（为μl） 3.2 16.3 0.5 20 7% 4.5 15.0 0.5 20 10% 6.5 13.0 0.5 20 30ml 5% 4.9 24.3 40 40 7% 6.8 22.4 0.8 40 10% 9.7 19.5 0.8 40