脂质过氧化及抗氧化剂抗氧化活性的检测方法

脂质过氧化及抗氧化剂抗氧化活性的检测方法

摘要：越来越多的研究表明，很多疾病和衰老现象都与脂质过氧化有关。本文对近年来脂质过氧化与抗氧化剂抗氧化活性的检测方法作简单综述，包括气相色谱、液相色谱、质谱、化学发光法等，并对不同方法进行了综合比较与评价。各种检测技术的对象各有不同，而且各有优缺点。因此，要针对不同的实验目的及条件来选择不同的检测方法。

关键词：脂质过氧化；抗氧化剂；抗氧化活性；检测

Lipids peroxidation and the Detection Methods of

Antioxidant activities of Antioxidants

Abstract

Lipid peroxidation has received considerable attention because of its possible contribution to the potential damage of biological systems. The study on the mechanism and the protection of lipid peroxidation are concerned to our living and health. Lipids peroxidation and the methods of determination of peroxidation and antioxidant activities in biological systems were reviewed, including Gas chromatography, Liquid Chromatography, MS, Chemiluminescence and so on. Different methods are compared comprehensively and evaluated. A variety of detection technologies have different target clientele, but also have their own advantages and disadvantages. Therefore, it is necessary for different experimental purposes and conditions to choose a different detection method.

Keyword: lipid peroxidation, antioxidant, antioxidant activity, detection

在生物体内，很多脂类含有高不饱和脂肪酸，特别在生物膜的磷脂中，高不饱和脂肪酸含量极高。由于不饱和脂肪酸双键电子云密度大，化学性质很不稳定，很容易受到过氧化作用的损伤，产生有细胞毒性的脂质过氧化物。这些化合物能破坏人体细胞正常的生理功能，促使人体衰老和诱发癌症。目前，国内外关于氧化应激、自由基损伤和生物抗氧化的研究主要集中在食品、化妆品、生理学、流行病学和医学等领域，从分子水平上研究其作用机理、基元反应和结构/活性关系的工作尚不多见，许多基础理论问题尚待解决。因此，脂质过氧化的检测方法在反应机理的研究中就显得尤为重要。

各种抗氧化物质抗氧化作用的强弱取决于其抗氧化的能力（或称抗氧化活性，Antioxidant Activity）。抗氧化能力的测定方法有许多种，有直接的，也有间接的，还有简便的总抗氧化能力（TAC）试剂盒等。这些方法都有一定的优缺点或局限性（或专用性），测定原理也各不相同。因此，为获得准确的评价结论，还需综合评估各种方法，以获得满意的结果[1]。

1 脂质过氧化反应的机理

脂质过氧化作用(Lipid Peroxidation)是自由基生物学的一个分支，是指脂类（RH）的多不饱和脂肪酸（PUFA）与自由基反应，形成中间体自由基，再与分子氧形成脂质过氧化自由基，引起酸败变形[2]。生物膜的脂质中含有较多的多烯不饱和脂肪酸，易发生脂质过氧化而损伤膜的功能与结构。正常生命过程产生的自由基是维持生命所必须，但若浓度过高则对

机体有害。体内自由基的产生与清除处于动态平衡中，一旦平衡破坏就危害机体。环境中有多种因素促使自由基的产生，引起脂质过氧化，例如电离辐射、紫外线、臭氧、废气、杀虫剂、除草剂、光敏剂及金属离子等等[3]。

自由基是指一类可以独立存在的含有未配对电子的物质，包括分子、原子、原子团或离子。若这类物质含有不配对电子的含氧基团称为氧自由基（Oxyen Free Radicais, OFR），主要包括超氧阴离子自由基（O2-）、过氧化氢（H2O2）、羟自由基（HO•）、单线态氧（1O2）等。这些不成对的电子使OFR具有不稳定性和高反应活性[4、5]。

脂质过氧化过程是一个产生自由基和自由基参于的链式反应，可分为三个阶段：

1.1 诱导阶段（Induction step）

RH→→ R•+ H•

1.2 传播阶段(Propagation step)

R• + O2 →→ROO•

ROO• + RH→→ROOH + R•

生成的ROOH很容易发生各式各样的分解反应，例如：

ROOH→→RO• + HO•

RO• 和HO•都是非常活泼的自由基，与RH起反应均能生成R•：

RO• + RH→→ROH + R•

HO• + RH→→H2O + R•

1.3 终止阶段(Termination step)

各种自由基在量的增加后相互结合，链式反应终止：

R• + R•→→RR

ROO• + R•→→ROOR

ROO• + ROO•→→ROOR + O2

式中的RH为参加反应的油脂中的不饱和底物，H是邻近双键两旁的亚甲基上的氢原子。反应过程中产生的R•、ROO•、RO•及HO•等自由基均可以由自旋共振仪测定。

2 脂质过氧化的检测

2.1 脂质过氧化底物的检测

2.1.1 氧耗

不饱和脂肪酸发生脂质过氧化的过程伴随有氧气的消耗，因此氧耗也成为检测脂质过氧化的指标之一，氧耗的测定可采用Wills测压法及氧电极法，后者较为常用。而且此法只需一个氧电极即可，利用氧电极可以很方便的测量溶液中的氧浓度，因此，可以用它检测一个反应体系中的氧消耗以研究自由基产生的动力学过程。氧气吸收的量用电子电位差计记录，它还可以连续检测脂质过氧化的进程，但体系必须是封闭的。

最近，又发展起来一种自旋探针测氧法，它是利用自旋探针ESR波谱的超精细结构随氧浓度改变来测量一个反应体系中氧浓度的方法。氧气是一个顺磁性的三重态分子，它可以和自旋探针的未成对电子产生自旋相互作用，使自旋探针的ESR波谱产生自旋-自旋增宽，使本来存在的一些超精细结构无法分辨。利用超精细结构随氧气浓度的改变就可以测量该体系中浓度和氧的消耗。但利用这一方法测量生物体系氧消耗的时间不能太长，也不能有氧化还原反应。

2.1.2 增重法

脂质过氧化过程中必定要吸收一定的氧，底物吸氧后形成过氧化物增重。通过对氧化混合物作NMR分析，由乙烯基质子峰面积可以得出不饱和脂肪酸氧化随时间变化的情况。此法只适用于常温下的反应，且底物体系中无易挥发的物质。