结核病的实验室诊断技术及应用ppt课件

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T-SPOT结果的解读-阳性结果
• 活动性结核病 — 典型结核中毒症状 — 影像学支持 — 排除其他诊断
• MTB感染状态 — 典型结核中毒症状 — 未发现结核患病证据
• 潜伏性结核感染 — 无结核中毒症状 — 无其它结核患病证据
• 陈旧性结核 — 无结核中毒症状 — 既往TB史或明确TB证据
• NTM（四种）感染
+
+
M bovis
+
+
BCG substrain
-
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gothenburg
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moreau
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tice
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tokyo
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danish
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glaxo
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montreal
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pasteur
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环境分枝杆菌
M abcessus M avium M branderi M celatum M chelonae M fortuitum M gordonii Mintracellulare
• 是结核分枝杆菌DNA检测技术的代表-灵敏、快速、 特异、简捷将会极大地推动结核病的防治工作
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DNA检测---LAMP
结果判读： 显色目测或 SYBR Green I 等荧光染料
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LAMP法和其他PCR法的比较
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LAMP法在结核菌检测中的应用
临床试验
—— LAMP法和对照试剂（BD快速培养）对比结果
分枝杆菌） ✓ 操作复杂，时间长；对于原发感染初期或免疫低下人群，
可能存在假阴性。 能否疗效监.测？——无大量数据
三、结核DNA检测技术
• 测序——金标准 • 荧光定量 PCR • 环介导恒温扩增法（LAMP） • 基因芯片检测鉴定技术 • 基因Xpert MTB/RIF检测技术
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1. 荧光定量 PCR
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TB-SAT操作流程
痰液预处理
TB-RNA释放
超声波（300W） 15 min
50 µl 稀释液
42℃ 40 min
恒温扩增 实时检测
全程2小时，会做 PCR，就学的. 会SAT
与反应液混合
60℃10 min 42℃ 5 min
TB-SAT检测技术优点
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RNA诊断技术的优势
➢ 灵敏度高：RNA ≥ DNA拷贝数 ➢ 与临床相关性好：区分“死活菌”：
《摘自2014年中国结核病监测报告》
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结核病检测技术发展历程
分子诊断时代
细菌法： 直接镜检 体外培养
19世纪中叶
n 灵敏度低 n 检测周期长 n 成本低
免疫学检测： Ab Ag PPD
T-SPOT
20世纪60年代
DNA诊断：
PCR LAMP GeneXpert 基因芯片
20世纪80年代
n 血清学检测 WHO不推荐
n r-干扰素释放实 验
n 交叉污染 n 仪器要求复杂 n 反应抑制
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RNA诊断：
TMA NASBA
SAT
20世纪90年代
n 高灵敏度 n 高特异性 n 交叉污染少
一、细菌法 直接涂片 （阳性率低—5000以上细菌/ml；
不能区分真假、死活）
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一、细菌法 结核菌的培养
结核病病原学诊断的金标准 (培养时间长是其软肋)
结核病实验室诊断技术及应用
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全球范围内结核病疫情急剧恶化 全球1/3人口（约20亿）已感染了结核菌， 人口的大规模流动 结核病与艾滋病同时流行 结核菌耐多药菌株的出现 我国是世界上仅低于印度和印尼的第三结核病大国 患病率高， 新发患者93万/年，结核菌感染率为约40％ 死亡率高，每年死亡人数达13万 耐药率高 早期快速诊断与治疗成为制约结核病防控的关键因素 常规结核病实验室检测方法诊断阳性率不到60％。
Interferon-Gamma Release Assays
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结核杆菌特异抗原：ESAT-6与CFP10
ESAT-6 : 早期抗原靶6（Early Secreted Antigenic Rarget 6） CFP10 : 培养滤液蛋白10（Culture Filtrate Protein 10）
➢ 灵敏度＝89.54% ➢ 特异性＝98.93% ➢ 总符合率＝95.31%
阳性结果预期值＝98.13% 阴性结果预期值＝93.77%
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3. 基因芯片检测技术
Ø 通量：可同时检测 16-22种常见分枝杆菌 Ø 速度：6小时 Ø 灵敏度： 103 CFU/ml Ø 可自动或肉眼判读结果
结核
胞内
Journal of Clinical Microbiology. 2010, 48(10): 3654–3660.
M kansasii
M malmoense M marinum M oenavense M crofulaceum
M smegmatis
M szulgai M terrae M vaccae M xenopi
抗原
ESAT6
+ + + + -
CFP-10
+ + + + -
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准确—T-SPOT临床诊断性能
高孟秋 ，γ-干扰素释放试验检测结果的临床 意义解读，中华结核和呼吸. 杂志，2014
T-SPOT的应用
➢ 优点：使用血液标本，取样简单；可用于肺内和肺外结核 检测；阴性预测值很高，可用于排除结核感染。
➢ 缺点： ✓ 阳性预测值约80%，不能用于结核的确诊 ✓ 不能确定是否是肺结核（肺外） ✓ 不能区分是活动性和潜伏性结核 ✓ 不能区分某些非结核分枝杆菌（堪萨斯、苏氏、戈登、海
• 是应用最为广泛的TB-DNA定量PCR检测方 法
• 具有灵敏度高（10CFU/ml）、特异性强、 线性关系好、操作简单等优点。
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2.环介导恒温扩增法（LAMP）
• 是在恒温下进行PCR扩增，因此操作更为简便，反 应更加快速。65℃扩增40min即可用肉眼观察结果。 扩增阳性标本呈现绿色荧光，反之为阴性。
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检测全程仅需6小时
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同时鉴定MTC与21种NTM
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4.Xpert MTB/RIF检测技术
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GeneXpert应用
•1、TB复合群鉴定。 •2、利福平耐药检测 。 •3、WHO推荐 •4、Xpert®MTB/RIF检测试剂的阳性检出率 低于人们对分子生物学诊断试剂高敏感度的 预期值，（1000CFU/ml）
杆菌等18种
Novel Real-Time Simultaneous Amplification and Testing Method To Accurately and
Rapidly Detect Mycobacter.ium tuberculosis Complex
J.Clin.Microbiol.2012,50(3):646.DOL:10.1128/JCM.05853-11.
Ø美国FDA数据：灵敏度95.6%(175/183) Ø国内临床数据：灵敏度95.3%(624/655)
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T-SPOT相关指南
•T-SPOT®.TB是采用γ-干扰素释放试验（IGRA）原理，获得
美国FDA认证、欧盟CE认证和首个中国CFDA认证的商业化 产品
•列入欧美25个国家结核诊疗指南 2011年英国NICE指南、2010年美国最新结核诊疗指南、
减少抗生素滥用 ➢ 可以诊断“活动性感染”：
活动性感染：RNA转录活跃 潜伏感染：RNA不转录 ➢ 不易污染：靶标和扩增产物都是RNA
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TB-SAT检测区分MTB和NTM
结核分枝杆菌复合群 （MTB）：
人型结核分枝杆菌 牛型结核分枝杆菌 非洲型结核分枝杆菌
非结核分枝杆菌 （NTM）：
研究表明，TB-SAT可 以区分如下NTM：堪 萨斯分枝杆菌、胞内分 枝杆菌、龟分枝杆菌、 戈登分枝杆菌、海分枝
液体培养 （BD MGIT960）
13.63±7.14
22.94±9.55 32.00% 9.30% 6.57%
固体培养 （罗氏L-J）
28.67±10.04
28.53±10.40 17.90% 2.60% 4.0%
液体培养在提高阳性率、缩短报阳时间上均优于固体培养。
仍然不能满足临床快速诊断的需要
吴学兵，陆彬，桂晓虹等。液体MGIT培养法在结核分枝. 杆菌检测中的应用评估。检验医学，2013,3（28）：211-214
• 特异性
阴性预测值：93.9%（478/509） 阳性预测值：95.4%（624/654）
只针对结核分枝杆菌复合群敏感，与绝大多数环境分枝杆菌和卡介苗（
BCG）无交叉反应
Ø美国FDA数据：特异性97.1%(297/306) Ø国内临床数据：特异性94.1%(478/508)
• 灵敏度
基本不受免疫力低下/受抑制影响，在肺外结核患者中有很高的检出率
高孟秋 ，γ-干扰素释放试验检测结果的临床 意义解读，中华结核和. 呼吸杂志，2014
T-SPOT结果解读-阴性结果
除外结核感染 — 所用抗原为MTB特异性抗原 — 机体没有结核特异抗原致敏的T淋巴细胞 — 目前未感染结核分枝杆菌
假阴性： •感染阶段不同（窗口期） •少数免疫系统功能不全/基础疾病的情况，如HIV感染者、肿瘤患者、婴幼儿 等 •特殊肺外结核：结核性脑膜炎、粟粒性结核灵敏度相对较低 •实验非正常操作：细胞计数不够等
二、免疫学检测
➢血清学检测（抗体、抗原） ➢结核菌素试验（灵敏度、特异性？） ➢结核感染T细胞检测（γ-干扰素检测）
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WHO关于血清学检测声明
2011年7月20日，世界卫生组织（ WHO ）正式声明，要 求禁止将 血清学检测方法 （抗原，抗体，蛋白芯片等）用
于肺结核和肺外结核的诊断。
WHO warns against the use of inaccurate commercial serological tests for pulmonary and extra-pulmonary TB.
效应T淋巴细胞分泌的γ-干扰素 与膜板预包被的抗γ-干扰素抗体 结合并固定在细胞周围
过夜孵育，洗板，加入酶标二抗
加入显色液，观察结果
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1个斑点=1个效应T细胞
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实验效果图
阴性结果
空白对照
抗原A ESAT-6 抗原B CFP10
阳性对照 （PHA）
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阳性结果
一 个 斑 点
巴一 细个 胞结
核 效 应 淋
VIVIAN JONAS,et al. JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, Sept.1993, p.2410-2416 CLAUDIO PIERSIMONI, et al. JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY,Jan.1997, p.193–196. GABRIELLE M. E. ANTIMICROBIAL AGENTS AND CHEMOTHERAPY, Sept. 1994, p. 1959-1965
蛋白质组学的发展
3、4、7种结核杆菌优势表位抗原
（16KD、38KD、MPT64、ESAT-6、CFP10、Mtb8、Mtb8.4、
Mtb16.3）制备多靶点蛋白微阵列
大量的文献报道其敏感性
特异性均显著高于涂片与培养法
可用于结核病的临床辅助诊
断，提高痰涂片和痰培养假阴性的检测率
参考文献略
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γ-干扰素释放实验（IGRAs)
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DNA用于临床检验的不足
➢ “死菌检测呈阳性”，与临床相关性差 ➢ 不能区分“潜伏感染”“活动性感染” ➢ 易交叉污染 ➢ 反应易受抑制
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四、常见的RNA检测技术
➢NASBA（国外） ➢TMA（国外）
➢SAT（国内）
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TB—SAT 检测技术
SAT技术是将核酸恒温扩增和实时荧光 检测相结合的一种新型RNA检测技术。
•由结核杆菌基因组RD1区相同的操 纵子编码的蛋白 •所有的卡介苗（BCG）均丢失RD1 和RD2 •绝大多数的环境分枝杆菌(NTM)也 不存在RD1和RD2区
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结核杆菌特异抗原：ESAT-6与CFP10
结核菌群
抗原
ESAT6
CFP-10
M tuberculosis +
+
M africanum
活菌检测技术，可用作肺结核治疗效果评估
• 据文献报道：每个结核分枝杆菌含有约2000个拷贝rRNA
• 研究表明：rRNA与结核分枝杆菌的生活力有着很好的相 关性， rRNA可以反映结核分枝杆菌的死菌活菌状态
• 研究表明：在用药治疗期内，随着结核分枝杆菌的死亡， rRNA大约在7天左右时间全部降解。而DNA含量几乎保持 不变
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一、细菌学检测的新方法 —提高阳性率
➢ 发光二极管荧光显微镜（LED） ➢ 液体培养（可同时缩短培养时间） ➢ 自动化涂片/染色技术（夹层杯法）
不能区分真假、死活；培养仍是金标准 但耗时长、
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分枝杆菌固体培养与液体培养比较
疑似新发患者报阳时间 （d）
复诊患者报阳时间(d) 疑似新发患者阳性率
复诊患者阳性率 污染率
2010年Hale Waihona Puke Baidu拿大结核指南
•美国CDC推荐—卡介苗（BCG）接种人群结核感染检测首选
• 国内风湿科和消化科已列入专家共识
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快速—T-SPOT的实验步骤
用BD CPT 管或Ficoll提取液收集外周 血单个核细胞
结核特异抗原（ESAT-6/CFP 10）刺激 结核特异的效应T淋巴细胞使其分泌γ干扰素