荧光原位杂交技术在活性污泥菌群识别中的研究进展

荧光原位杂交技术在活性污泥菌群识别中的研究进展
费学宁1曹阳1郝亚超1池勇志1李玉友2
（1天津城市建设学院环境与市政工程系天津市重点实验室天津300384；
2日本国立东北大学土木工程系仙台980-8576日本）
摘要荧光原位杂交技术（FISH）广泛地应用于分析环境微生物的群落组成，能够同时对微生物进行定性、定量分析，并确定微生物群落空间分布情况。

本文阐述了FISH法应用于活性污泥处理系统的重要作用，综
述了FISH法在活性污泥及生物膜微生物菌群的组成、结构与功能的研究和应用，同时讨论了其在应用中存在
的不足，并在此基础上总结了一系列可供改进的措施，最后对FISH的灵敏度、靶向性的改性等进行了展望。

关键词荧光原位杂交（FISH）活性污泥微生物菌群生物标记靶向性
Advances in Identification of Activated Sludge Bacteria by
Fluorescence in situ Hybridization
Fei Xuening1，Cao Yang1，Hao Yachao1，Chi Yongzhi1，Li Yuyou2
（1Tianjin key laboratory，Department of Environmental and Municipal Engineering，Tianjin Institute of Urban
Construction，Tianjin300384；2Department of Civil Engineering，Tohoku University，Sendai980-8576Japan）
Abstract Fluorescence in situ hybridization（FISH）technology has been widely used to analyze the composition and distribution of microbial communities，both qualitatively as well as quantitatively．This review
presents the activated sludge treatment tactics applied FISH technology，formulates influence of the technology on the
composition，structure and function of bacterial communities，argues some major weak points and offers suggestions
for future directions in applying the technology targeting and sensitivity designs．
Keywords Fluorescence in situ hybridization（FISH），Activated sludge，Microorgamisms，Biological Tag，Targeting
随着全球经济快速发展和用水量的急剧增加，污水处理厂在控制水污染、保护水环境方面发挥了越来越重要的作用。

目前我国有80%的污水处理厂采用活性污泥法处理污水［1］。

活性污泥法降解能力强，处理程度高，但活性污泥的稳定性难题一直有待解决［2］。

活性污泥中微生物菌群的组成、结构与功能决定了活性污泥和生物膜的生物活性，继而从根本上决定了废水生物处理系统的污水处理能力［3］。

我国绝大部分污水处理厂存在不同程度的污泥膨胀现象，活性污泥系统的不稳定性影响出水水质、增大污泥的处理费用，并且极易引起大量污泥流失，严重时可导致整个处理工艺难以短时间恢复［4］。

因此，研究活性污泥及生物膜微生物菌群的组成、结构与功能，对于提高废水的生物处理效率具有重要意义。

传统的微生物菌群结构分析方法包括显微镜观察和分离培养、依据形态结构特征和生理生化特征进行分类鉴定等。

这些方法能从活性污泥中分离和鉴定大量细菌，并对微生物的多样性和动力学进行分析，但此类方法非常耗时［5］，不足以反映微生物在环境中的真实情况，存在很大的局限性［6］。

近年来，针对传统的微生物分析方法存在的问题，废水处理领域的一些研究者开始尝试将荧光原位杂交技术（fluorescent in situ hybridazation，FISH）用于引起污泥膨胀的丝状菌菌群、脱氮细菌菌群、除磷菌菌群、产甲烷菌菌群等的分析，并取得了初步的成功。

FISH作为微生物数量和特性考察的手段，具有种属特异性，即只与目标细菌的16S rRNA或23S
天津市自然科学基金项目（08JCYBJC13200）资助
2010-10-25收稿，2011-02-24接受
rRNA 结合，通过结合的探针可以鉴定微生物的种类。

与其他可以将微生物量化的方法（如定量聚合酶
链式反应即PCR ）相比，
FISH 技术可以同时考察微生物群落的结构和数量信息［7］。

研究表明，FISH 技术对特定微生物种群定性和定量时，获得结果快，可自动读取、保存和回顾载物片信息，灵敏度高、选择性好、取样易且少，并能提供较多的物理参数。

1
FISH 技术的发展及技术原理1.1FISH 的发展
1969年，Pardue ［8］和Gall ［9］两个研究小组发明了原位杂交技术（in situ hybridization ），将放射性标记
的DNA 或28s RNA 杂交到细胞制备物上，通过放射自显影技术（microautoradiography ，
MAR ）检测杂交位点，该技术可在不破坏细胞完整形态的情况下在细胞内检测核酸序列
［10］。

1988年，Giovannoni 等［11］首次将FISH 应用到细菌学的研究中，使用放射性标记rRNA 寡核苷酸探针检测微生物。

随着荧光标记的发展，放射性材料被非同位素染料代替。

1989年，DeLong 等［12］首次将荧光标记寡核苷酸探针用于检
测独立的微生物细胞。

与放射性探针相比，荧光探针具有分辨力强、安全性高、检测步骤少的优点［10］。

在伸展性DNA 纤维（extended DNA fiber ）上进行FISH ，已将分辨率提高到与常规分子生物学技术Southern Blot 分析相当的水平。

近几年，由于FISH 技术的灵敏性和快捷性，该技术已成为微生物系统
发育学、
微生物生态学、微生物诊断学和环境微生物学研究的有力工具。

1.2FISH 的技术原理
FISH 是将细胞原位杂交技术和荧光技术有机结合而成的新技术。

将待测微生物基因组核酸分子
变性后，
利用荧光标记的特异寡核苷酸片断作为探针，依据碱基互补原理，与变性后的DNA 或RNA 分子进行原位杂交［13］，在一定激发波长下用荧光倒置显微镜、放射自显影、流式细胞仪或激光扫描共聚焦显微镜等手段对杂交信号进行检测和扫描，并用相关统计软件分析其与活性污泥类型和运转效能间的关系，或建立数学模型用于预测活性污泥的运转状况。

16S rRNA 基因存在于所有细菌的染色体中，具有系统发育上的相对保守性，且分布广泛、功能稳定，同时核苷酸数目适中，所以FISH 技术通常将16S rRNA 作为探针结合对象。

16S rRNA 的保守性是相对的，不同细菌的16SrRNA 序列有着不同程度的差异，针对目标微生物体内某段有差异的序列设计出相应的寡核苷酸探针，就可以实现对目标微生物的原位检测［13］。

图1和图2为FISH 过程的原理图。

图1
FISH 过程原理图：变性［14］Fig．1The Process of FISH ：denaturation ［14］图2FISH 过程原理图：杂交［14］Fig．2The Process of FISH ：hybridization ［14］
1.3FISH 探针及标记
FISH 所采用的探针必须具有特异性强，灵敏度高，良好的组织渗透性。

一个典型的寡核苷酸探针
长度一般是15 30bp
［16］。

FISH 技术的常用探针可分为3类：第1类是包括α卫星和卫星Ш类的染色体特异重复序列探针；第2类是全染色体或染色体区域特异性探针，由一条染色体或其上某一区域几段不同的核酸片段组成；第3类是位点特异性探针，这类探针由1个或几个克隆序列组成
［15］。

FISH 技术所用探针的标记方法有直接标记法和间接标记法。

间接标记法是指将标记物（如地高辛、生物素）连接到探针上，再利用偶联有荧光染料的亲和素或抗体进行检测的方法［16］。

直接标记法是
用荧光染料直接标记核苷酸，该方法的探针标记种数不受限制，比间接标记操作简单，但不如间接标记探针灵敏，不过靶序列片段较大时（数百kb），测量结果仍较可靠［15］。

表1列出了常用的寡核苷酸探针。

表1一般常用的寡核苷酸探针［40］
Tab．1Probes in common use［40］
探针序列（5’-3’）目标位置16S-rRNA特异种属UNIV1392ACGGGCGGTGTGTRC1392-140通用探针
EUB338GCTGCCTCCCGTAGGAGT338-355细菌类
ARCH915GTGCTCCCCCGCCAATTCCT915-934主要古菌（EUB338以外）
ALF1b CGTTCGYTCTGAGCCAG19-35α-亚纲变型菌及其他
BET42a GCCTTCCCACTTCGTTT23S1027-1043β-亚纲变型菌
GAM42a GCCTTCCCACATCGTTT23S1027-1043γ-亚纲变型菌
CF319a TGGTCCGTGTCTCAGTAC319-336CFB门Cytophaga-Flavobacterium类菌
HGC TGTAGTTACCACCGCCGT1901-1918高G+C DNA含量革兰氏阳性细菌
2FISH技术定量、定性方法
FISH定量、定性方法包括荧光显微镜下的人工计数、计算机图片处理算法和光密度测定法，本文简要介绍前两种方法。

2.1荧光显微镜下人工计数
荧光显微镜下人工计数过程如图3所示，对每个样品制作2个载玻片，然后在荧光显微镜下对处理好
的载玻片中的每个视野进行观察、计数，图中A表示算术平均处理后的细菌数，A
1、A
2
分别为2个载玻片的
算术平均细菌数，而细菌浓度与A成正比，同时与试样面积S（mm2）和视野面积S
A
（mm2）之比呈正比，N
为试样量（μmL），通过公式：细菌浓度=1000/NˑAˑS/S
A
（细菌数/mL）［17］可求出具体细菌浓度。

图3FISH人工计数过程图
Fig．3Factitial Counting Process of FISH Image
荧光显微镜下计数的方法有其固有的缺点，耗时长，能杂交的细胞数量有限，并且需高放大倍数的共焦激光扫描显微镜（CLSM）观测［18］。

2.2计算机图片处理算法
荧光显微镜设备一般本身自带图像分析软件，计算机图片处理算法首先对固定好的杂交样品进行数字图像分析，根据不同浓度时被检测物质在总标记物中的面积比绘制对数曲线图，然后根据回归方程将测验结果折算成真实浓度。

3FISH技术实验步骤［41］
3.1玻片处理
为使样品和玻片更好地结合，首先用覆膜剂处理。

常用的覆膜剂有明胶、聚-L-赖氨酸等。

3.2固定样品
常用的固定液有甲醛水溶液-乙酸（Formalin-Acetic Acid，FAA）、低聚甲醛（Paraformaldehyde）和戊
二醛（Glutaraldehyde）。

3.3样品预处理
采用梯度脱水法对样品进行脱水处理，用表2中的8个梯度从上至下依次脱水，自然干燥。

3.4原位杂交
先进行HCl处理和蛋白酶K消化；然后进行固定和脱水，依次用40mg/mL低聚甲醛/磷酸盐缓冲液（PBS）、1ˑPBS和1mL/L乙酸酐与0.1mol/L三乙醇胺（TEA）配成的溶液，先后对样品进行固定处O、15%、30%、50%、70%、85%、95%和100%乙醇梯度脱水，自然干燥。

然后进行杂交，将理，再用H
2
探针加到杂交液中，预热至45ħ，提前打开42ħ培养箱，预热湿盒。

每个玻片小槽涂40μL，盖上盖片后用石蜡烃薄膜（parafilm）封紧边缘。

将载片放于湿盒于42ħ过夜，然后放入37ħ2ˑSSC的冰盒中，漂去盖片，再洗脱。

表2梯度脱水［41］
Tab．2Gradient dehydration［41］
级别12345678
DEPC水40301500000
无水乙醇5050505025000
叔丁醇1020355075100100100
3.5洗脱和核糖核酸酶处理
先后于37ħ下在染色缸中用2ˑSSC和1ˑSSC洗2ˑ15min，然后进行核糖核酸酶（RNase）处理，把40μL20mg/mL RNase储液加入到40mL NTE中（终浓度20μg/mL），放入载片，37ħ温育30min。

37ħ下0.5ˑSSC洗2ˑ15min。

放入PBS中，4ħ过夜或直接进行检测。

由于氢键具有微弱性，互补的单链核苷酸分子经退火而形成核酸双链分子的过程是可逆的，改变反应的物理和化学条件可影响核酸双链分子生成的速度、转化率及其稳定性。

影响2段互补核苷酸链杂交的主要因素包括温度、pH、溶液中单价离子的浓度、甲酰胺浓度［7］。

4FISH技术的应用
FISH能再现为环境中完整细胞的影像信息，具有较好的精确性，已在细胞遗传学、肿瘤生物学、基因定位、基因作图、基因扩增、产前诊断及哺乳动物染色体进化研究等领域得到了广泛应用。

近几年来，FISH在水污染控制微生物生态学中的应用也得到了一定发展。

常规的方法是通过检测特异底物转化率来研究活性污泥中重要功能菌群的活性，如氧消耗率、硝化、反硝化、磷吸收和释放、Fe3+的还原等［11］。

放射自显影和FISH（MAR-FISH）可结合用于研究水体微生物，能同时获得复杂环境中特定微生物的种属和功能特性，检测细菌活性、数目和对特异有机底物的消耗特点［19］。

此外，FISH技术还常和PCR、变性梯度凝胶电泳法（DGGE）等技术结合使用。

4.1FISH技术在颗粒污泥和生物膜的菌群结构研究中的应用
目前主要是根据颗粒污泥切片的扫描电镜照片来推测厌氧颗粒污泥的结构，但是细菌本身的多态性决定了这种方法存在明显不足，而利用FISH技术可以在一定程度上真实反映出颗粒污泥内部微生物的组成和空间分布情况［20］。

Flaherty等［21］将共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）与FISH结合使用，对厌氧反应器中颗粒污泥的污泥菌群组成、分布和定量识别等方面进行研究，这种结合技术表现出了巨大的应用潜力。

Sanctis等［25］利用FISH技术跟踪研究序批式生物滤池（SBBGR）中污泥从接种到挂膜和形成颗粒污泥的过程中污泥菌群结构的变化，研究表明，颗粒污泥在形成过程中菌群组成发生明显变化，当以变形菌为主要的活性菌群稳定出现时，颗粒污泥处理污水的效果最好。

孙寓姣等［22］利用细菌探针EUB338-cy3和古菌探针ARC915-fitc对3个厌氧产甲烷颗粒污泥样品的超薄切片进行了FISH分析，得到了颗粒污泥样品中细菌的分布情况。

Weber等［24］将FISH技术与扫描电镜、光学显微镜和共聚焦显微镜结合起来，分析研究
了从生物膜的形成到好氧颗粒污泥的形成过程中污泥的结构，并对FISH法进行了改良。

4.2FISH在氨氧化菌、硝化细菌研究中的应用
传统研究硝化细菌的方法是将硝化细菌从环境中富集、分离，然后在形态学上加以分类、鉴定。

FISH技术利用硝化细菌特异性的靶寡核苷酸探针，在原位检测水环境或生物膜上的硝化细菌时，能同时实现定性、定量分析，为研究硝化系统中硝化细菌类群的空间和数量分布提供了有效的检测手段。

张丹等［26］应用FISH技术对氧限制自养硝化反硝化（OLAND）生物脱氮系统中硝化阶段不同时期硝化菌群的变化进行检测，揭示了随溶氧浓度的降低，氨氧化菌的数量基本保持恒定、亚硝酸氧化菌的数量略有减少的变化规律，并且发现在两阶段OLAND生物脱氮系统中氨氮的氧化主要是由Nitrosomonas sp．完成，亚硝酸的氧化主要由Nitrobacter sp．完成。

Pala等［27］应用FISH技术对中试膜生物反应器中硝化细菌菌群进行定性定量分析，结果表明，样品中的硝化细菌中亚硝化细菌是优势菌种，在总菌群结构中的相对丰度为13%，膜生物反应器性能与硝化细菌的浓度呈正相关性。

Rongsayamanont等［28］利用FISH法分析了不同条件下的硝化菌和氨氧化菌组成和数量，FISH样本通过倒置的奥林巴斯显微镜观察，并利用CLSM成像、观测，经BA505-525和BA565IF两种滤光片分别收集Oregon Green488标记的探针和若丹明红标记的探针发出的荧光；软件DAIME作为一种图像分析软件，帮助比较目标光源（标
记硝化菌和氨氧化菌所发荧光）在细菌总体光源中所占比例。

图4FISH-LSM成像图，硝化菌被包埋时以探针
NSO190和EUB338检测结果［28］
Fig．4FISH-LSM image of entrapped nitrifiers，hybridized with NSO190（in red）and EUB338［28
］图5FISH-LSM成像图，以探针NSO0190检
测的悬浮硝化菌［28］
Fig．5suspended nitrifiers，hybridized
with NSO190［28］
图4和图5为显微镜成像示例，其中红色代表硝化细菌（探针Nso190标记），黄色表示硝化菌和总菌的混合物，绿色表示总菌（探针EUB338标记）。

该试验表明，Nitrosomonos europaea是主要的AOB（氨氧化细菌），Nitrobacter属是主要的NOB（亚硝酸盐氧化细菌）。

4.3FISH技术在除磷过程中菌群结构研究中的应用
近年来，随着对污水生物法除磷机理的深入研究和对污水处理装置的不断优化，迫切需要更加快
速、准确和精细的分析手段来定性、定量处理系统中特定细菌并剖析其群落结构。

在对聚磷菌（PAOs
）
图6a）Neisser染色后的丝状体b）以探针GNSB941/CFX1223mix（CY5），CFX197（CY3）和EUBmix标记的CLSM-FISH 成像图c）以探针GNSB941/CFX1223mix（CY5）和CFX223（CY3）标记的CLSM-FISH成像图，紫红色丝状体表示对两种探针
均有反应的绿弯菌门（Chloroflexi）0092［32］
Fig．6a）Neisser-stained biomass；b）Confocal laser-scanning microscopy image of FISH-probed biomass hybridized with GNSB941/CFX1223mix（CY5），CFX197（CY3）and EUBmix probes；c）Confocal laser-scanning microscopy image of FISH probed biomass hybridized with GNSB941/CFX1223mix（CY5）and CFX223（CY3）probes［32］
的量化研究中，FISH这种技术被广泛应用［29］。

20世纪90年代初就有研究者应用FISH对PAOs进行研究，在不同规模的反应器和进水水质条件下，得到了不同优势种群的微生物，但是逐渐统一地认为β-Proteobacteria中的类似Rhodocyclus组菌起主要的聚磷作用。

Kawaharasaki等［30］采用DAPI荧光染料和α-，β-和γ-Proteobacteria特异性低聚核苷酸探针，对厌氧/好氧序批式生物强化除磷（EBPR）反应器中活性污泥聚磷酸盐积累菌（PAO）进行了识别。

结果表明，所采用的FISH技术是现场识别PAO细菌的有效方法，可为稳定操作EBPR工序提供有用的监控信息。

Burow等［31］采获了10个不同污水处理厂的污水样本，用FISH法观察了EBPR污水处理系统中的聚磷菌和聚糖菌：以EUBMIX（以FLUOS染色）标记总菌，DF1MIX和DF2MIX（以Cy3染色）分别标记组1和组2中的Alphaproteobacteria，用共焦激光扫描显微术结合ImageJ V1.35k对细菌Alphaproteobacteria 在总菌中的面积比加以分析。

结果表明，Defluviicoccus的存在量较小，不管是厌氧还是有氧情况下，组1和组2中的Defluviicoccus菌均有利用醋酸盐、葡萄糖、丙酮酸盐等物质的摄取习惯。

Ahn等［23］研究了好氧序列间歇式反应器中的微生物对低化学需氧量（COD）废水中磷的去除效果，采用FISH法对微生物进行定量、定性分析。

以Cy5、Cy3、FLUOS3种染料对探针DECH454和DECH472染色，分别对2种水样中的Dechloromonas加以标记，结果表明2种水样中均存在大量该菌，利用MAR-FISH技术还检测到系统中起主要除磷作用的PAO为Candidatus Accumulibacter phosphatis。

4.4FISH技术在检测发生污泥膨胀时丝状细菌中的应用
Speirs［32］等利用FISH技术对污水中的丝状菌进行检测，发现污泥膨胀中常出现的Eikelboom type 0092属Chloroflexi门，在全面强化除磷系统中，该丝状菌以2种不同的变异体出现，且在大部分情况下是同时存在的。

如图6中的3张分析图，图a表示对水样进行Neisser染色时大部分的水样都有对该染色有反应的短径丝状体；利用FISH分析水样，EUB338I，II，和III均无法标记丝状菌，用探针GNSB941和CFX1223标记时，则可以检测到荧光信号，如图b；图c中的紫红色表示的是对探GNSB941/CFX1223 mix（CY5）和CFX223（CY3）均有反应的绿弯菌门（Chloroflexi）0092。

5FISH技术的不足与展望
FISH技术的优势在于可以了解微生物在污泥中的数量、形态及分布状态等，但其在应用过程中还存在着检测的假阳性、假阴性问题，诸如：微生物自身荧光的影响、探针缺乏特异性、穿透率不足、低rRNA含量和荧光褪色等［7］。

作为一项新兴的研究手段和工具，在今后的研究工作中还需要在以下几个方面进行加强和改进：（1）优化杂交过程中的各种操作条件，如：杂交和洗脱的温度、变性剂浓度及探针长度和浓度，这些杂交条件在很大程度上决定着探针的特异性和灵敏性；（2）开展探针标记技术的研究，提高探针灵敏度，完善荧光信号检测技术。

探针与被检测物的结合强度是保证灵敏度的一个关键前提，合适的荧光团和探针对FISH检测效果有较大影响。

量子点荧光标记探针与传统荧光探针相比，荧光强度高，化学稳定性好，抗光漂白性能强，可实现对细胞的多色标记。

Mitchell等［33］利用量子点表面的Zn原子与巯基之间的配位作用实现了对目标DNA分子的检测。

Pathak等［34］首先将羟基吸附在量子点表面，经过一系列的反应，最后将不同的寡聚核苷酸通过氨基甲酸酯偶合到羟基上。

这种多色的量子点寡聚核苷酸探针可稳定存在几个月，并且解决了核酸探针在杂交过程中的非特异性键合问题，将其用于原位杂交过程，可进一步检测染色体的异常和突变；（3）新型探针的研究设计，如PNA（Peptide Nucleic Acid，即核肽酸）探针。

该探针稳定、不易降解，其主链骨架呈中性，通常比寡核苷酸探针短，表现出较好的渗透性。

PNA 探针技术在微生物检测领域具有极大的潜力。

尽管目前对其研究仍然在初步阶段，但随着进一步的研究，它的广泛应用指日可待［35］；（4）FISH技术主要应用在细胞组织内部，根据碱基配对原理，利用荧光探针与目标细胞中的同源16s rRNA特异结合，从而达到研究细胞的目的。

这种在不破坏细胞的情况下发生在组织内部杂交反应，存在许多不稳定的问题。

如荧光发生褪色、低16s rRNA含量、探针损伤，以及穿透率不足带来的杂交率低，都将影响到后来的细胞观察准确率。

如果这种杂交发生在细胞膜表面，则可以解决很多由于穿透率不足、内部组织影响带来的褪色问题。

探讨细胞的具体结构、细胞膜上对特
异探针的结合点即靶点，可实现细胞膜上的直接杂交，减少FISH步骤和反应时间，从而能更好地对目标细胞进行观察和定量定性分析。

通过研究特定菌种的代谢途径、特定结构特征或摄食专一性，找到与细胞膜有关的特定物质，可实现靶点标记。

将这种技术应用在污水处理中，结合生物传感器等的使用，对优势菌等目标菌实现动态观测和分析，将是一个重大的突破。

具体可能实现的标记途径有：1）特定菌种的代谢途径，活性污泥中的各类菌种在处理污水中扮演着不同的角色。

菌种有其各自的代谢途径，研究其代谢机制，找出代谢途径中的专属功能物质，再通过对该种专属物质的结构展开分析选取染料标记物，实现对该种菌种的特异性标记；2）特定菌种的结构特征，研究各功能菌种的结构，重点掌握功能菌群膜结构或膜上特定物质的结构，通过特定膜物质结构与染料标记物结构中的化学键的结合，实现标记；3）特定功能菌种的摄食专一性，对功能菌种的摄食专一性进行研究，即探讨菌种特定的处理物质，从特定处理物质的结构入手，选取合适的染料对其标记，从而实现功能菌种的间接识别。

（5）加强FISH 技术与其他技术的联用：与共聚焦激光扫描显微镜和多光子显微镜的应用，可获得较好的景深和清晰的图象；与微传感器相结合也是FISH技术在环境微生物学中应用的又一技术手段，而结合荧光显微镜和流式细胞计的FISH技术是诊断和评价复杂微生物群落的种群结构及其动态学最有前景的技术手段［36］。

Victoria等［37］利用FISH与次级离子质谱（SIMS）结合对厌氧条件下的甲烷氧化菌进行了鉴定；Lee等［38］采用FISH与显微放射自显影技术研究了生化物质在细胞内的合成、转移和转化等代谢过程；Sekiguchi等［39］利用CLSM与FISH技术得到了不同菌种在颗粒污泥内部成层分布的高清晰照片。

目前FISH技术作为一种新型有力的研究工具，已被广泛应用于对活性污泥和生物膜的研究中，如污泥膨胀过程中特异性丝状菌的寻找与确定、硝化过程中氨氧化细菌和硝化细菌的数量分配与空间分布、生物强化除磷过程中放线菌和某种特异细菌的作用等。

FISH技术能很好的反映出废水生物处理系统中微生物菌群的多样性以及定量分析微生物种群的空间的动态变化。

随着技术不断进步，FISH技术的准确度和灵敏度将进一步提高，这必将在废水生物处理系统微生物菌群结构领域中得到更加充分的应用，从而为废水生物处理领域的基础理论研究提供强有力的武器，促进工程实践的快速发展，为污废水的控制作出贡献。

参考文献
［1］冯权，邢新会，刘则华．化工进展，2004，23（8）：832 836．
［2］JR Blackbeard，G A Ekama，G V R Marais．Water Pollutant Control，1986，85（1）：90 100．
［3］洪安安，刘德华，刘灿明．工业水处理，2009，29（2）：10 14．
［4］杨宝林．中国给水排水，1993，9（5）：32 34．
［5］V Deretic，M J Schurr，J C Boucher，D W Martin．J Bacteriol．，1994，76（10）：2773 2780．
［6］A K Rowan，J R Snape，D Fearnside et al．FEMS Microbiology Ecology，2003，（43）：195 206．
［7］罗思音，张可方，张立秋．水科学与工程技术，2009，2：27 29．
［8］ML Pardue，J G Gall．Proc．Natl．Acad．Sci．USA，1969，64：600 604．
［9］H John，M Birnstiel，K Jones．Nature，1969，223：582 587．
［10］刑德峰，任南琪，王爱杰．生物学通报，2003，30（6）：l14 119．
［11］S J Giovannoni，E F DeLong，G J Olsen et al．Bacteriol．，1988，170：720 726．
［12］EF DeLong，G S Wickham，N R Pace．Science，1989，243（4896）：1360 1363．
［13］李冰冰，肖波，李蓓．生物技术，2007，17（5）：94 97．
［14］王相平．大连医科大学硕士论文，2009．
［15］陈成忠，于洪芹．生物学教学，2007，32（1）：2 4．
［16］宋琳玲，曾光明，陈耀宁等．微生物学杂志，2007，27（1）：40 44．
［17］朱彤，张洪军，刘建峰等．环境保护科学，2007，3（1）：22 25
［18］张倩茹，周启星，陈锡时等．生态学杂志，2003，22（3）：49 53．
［19］王晓慧，文湘华．微生物学通报，2009，36（1）：142 148．
［20］左剑恶，杨洋，沈平等．中国沼气，2004，22（1）：3 6．
［21］V O’Flaherty，G Collins，T Mahony．Rev．Environ．Sci．Biotech．，2006，5：39 55．
［22］孙寓姣，左剑恶，邢薇等．环境科学，2006，27（11）：2354 2357．
［23］J Ahn，S Schroeder，M Beer et al．Appl．Environ．Microbiol．，2007，73（7）：2257 2270．
［24］S D Weber，W Ludwig，K H Schleifer et al．Appl．Environ．Microbiol．，2007，73（19）：6233 6240．［25］M De Sanctis，C Di Iaconi，A Lopez et al．Bioresource Technology，2010，101（7）：2152 2158．
［26］张丹，刘耀平，徐慧等．生物技术，2003，13（5）：1 3．
［27］I Pala，M Kolukirik，G Insel et al．Fresenius Environ．Bull．，2008，17（12）：2255 2261．
［28］C Rongsayamanont，T Limpiyakornc，B Lawd et al．Enzyme and Microbial Technology，2010，46：229 236．［29］颜强，谢有奎．重庆建筑大学学报，2004，26（6）：71 73．
［30］M Kawaharasaki，H Tanaka，T Kanagawa et al．Water Res．，1999，33（1）：257 265．
［31］L C Burow，Y Kong，J L Nielsen et al．Microbiology，2007，153，178 185．
［32］L Speirs，T Nittami，S McIlroy et al．Appl．Environ．Microbiol．，2009，75（8）：2446 2452．
［33］GP Mitchell，CA Mirkin，RL Letsinger．J．Am．Chem．Soc．，1999，121（35）：8122 8123．
［34］S Pathak，SK Choi，N Arnheim et al．J．Am．Chem．Soc．，2001，123（17）：4103 4104．
［35］赵欣，李霞，顾大勇．微生物学杂志，2008，28（1）：76 82．
［36］陈瑛，任南琪，李永峰等．哈尔滨工业大学学报，2008，40（4）：546 549．
［37］J O Victoria，H H Christopher，H Kai-Uwe et al．Microbiology，2002，99（11）：7663 7668．
［38］N Lee，P H Nielsen，K H Andreasen et al．Appl．Environ．Microbiol．，1999，65（3）：1289 1297．
［39］Y Sekiguchi，Y Kamagata，K Nakamura et al．Appl．Environ．Microbiol．，1999，65（3）：1280 1288．［40］孙寓姣，王勇，黄霞．环境污染治理技术与设备，2004，5（11）：14 20．
［41］呼庆，齐鸿燕，张洪勋．生态学报，2004，24（5）：1048 1054．
费学宁
1957年2月生于天津
1997年获天津大学应用化学博士学位
现天津城市建设学院教授、天津大学博士生导师
从事功能染料、生物细胞标记及污水资源化研究
E-mail：xueningfei@126．com。