粘杆菌素发酵工艺规程

原料药事业部**生物工程有限公司

目的：建立粘杆菌素发酵生产工艺规程，作为制定粘杆菌素发酵部分岗位SOP的依据;作为建立该生产线所需设备、人员、流动资金的依据；作为生产安全、环境保护等一系列规章制度的制订依据;供生产管理人员统一操作，保证工艺要求明确可行，产品质量合格，保证发酵持续稳定生产。

适用范围：粘杆菌素发酵生产。

责任人：粘杆菌素发酵全体工作人员均应对执行此工艺规程负责，各司其职。厂总工程师办公室、生产部、品保部负责抽查执行情况。

内容：产品概述：

粘杆菌素是由多粘杆菌（Baciccus Polymyxa）所产生的，由多种氨基酸和脂肪酸组成的一种碱性多肽类抗生素。一般药用粘杆菌素采用其硫酸盐。硫酸粘菌素主要对G-菌呈强大的抗菌作用，敏感菌有绿脓杆菌、大肠杆菌、克雷伯氏菌、沙门氏菌、巴氏杆菌等。粘菌素带有阳电荷的游离氨基能和G-杆菌细胞膜磷脂中带阴电荷的磷酸根结合，使细胞膜表面积扩大，通透性增加，细胞内的磷酸盐、核苷酸等成分外漏，导致细菌死亡。多粘菌素对肾脏有影响，有的还能影响中枢神经，用药个体可能会发生晕眩、共济失调和腿软等症状。肌肉注射时，常产生局部红肿、疼痛，在各种多粘杆菌素中，以多粘杆菌素B和E毒性最小，疗效最高，这是由于它们只含一个D—氨基酸残基，而多粘菌素A和D中各含两个D—氨基酸残基的缘故。硫酸粘菌素口服吸收少，在肠内可保持较高浓度；用于家禽、家畜的疾病治疗，药物代谢产物在机体内没有残留；它的配伍用药有阿奇霉素、氨苄西林等。需要说明的是，硫酸粘菌素目前禁用于兽药。本工艺多粘杆菌菌种发酵生产的主要产物是多粘菌素E。多粘菌素E的结构如下：

其中：Dab—α.r二氨基丁酸；MOA—（+）—b—甲基辛酸；IOA—异辛酸；Tnr—苏氨酸；Leu—亮氨酸。

→，表示第一个氨基酸的羧基和第二个氨酸的氨基相连的肽键氨基酸，未标明的都指L型。

粘杆菌素E1：R—MOA，X—Dab，Y—D—Leu，z—Leu

粘杆菌素E2：R—LOA，X—Dab，Y—D—Leu，Z—Leu

粘杆菌素E：分子量为1180，其硫酸盐的分子式为C

55H

104

N

16

O

12

·2.5H

2

SO

4

。

粘杆菌素是无定形白色粉末、味苦有引湿性，其硫酸盐或盐酸盐易溶于水，又能溶于甲醇或乙醇中，几乎不溶于醚或氯仿中。

粘杆菌素由于含有肽链和氨基，故对双缩脲、茚三酮反应呈阳性，而对α—萘酚试验、坂口试验（Sakaguchi test）、玻利（Pauly）和霍普金斯—科尔（Hopkins—Cole）反应呈阴性。粘杆菌素效价基准比较特殊，粘杆菌素E游离碱每毫克定为30000单位。

硫酸粘菌素pH：称取本品0.1g溶解于二氧化碳纯化水中，并稀释至10ml，依法检查，pH值应为4.0～6.0。

硫酸粘菌素比旋度：称取本品1.25g溶解于纯化水中，并稀释至25.0ml。按干燥品计算，比旋度范围在-63ｏ～-73ｏ。

硫酸粘菌素生物效价：以干燥品计，毫克效价不低于19000IU/mg。按微生物生物检测法测定。

1、原材料质量规格

序

号

原材料名称规格控制项目质量标准备注（产地）

1玉米淀粉工业外观

含量

水份

白色粉状

78%以上

≤14%

秦皇岛骊骅

2小麦胚芽粉工业

外观

粗蛋白

粗脂肪

灼烧残渣

细度

淡黄色粉状

≥26%

≤11%

≤6%

80目通过95%以上

广州市南方面粉有限公司

3葡萄糖工业

外观

含糖量

水份

灼烧残渣

白色或白色结晶粉

末

85%以上

10%以下

≤0.10%

秦皇岛骊骅

4硫酸镁工业外观

含量

白色或无色结晶

90%以上

广东光华化学有限公司

种子配料罐大配料罐

3、工艺过程

粘杆菌素生产采用纯种深层、通气搅拌二级发酵。发酵培养基配制第一料为液化淀粉、第二料含未液化淀粉和其它培养基组份、碳酸钙分消。消沫剂分消保压、25％氨水静止保压超过48Hr。培养基消毒采用实消法。培养基主要碳源为玉米淀粉，种子培养基可用少量葡萄糖，主要氮源是硫酸铵。发酵过程中，采用DCS系统自控补充氨水以调节pH、自控调节发酵罐搅拌转速与空气流量以调节溶氧浓度；在菌体生长与合成抗生素过程中产生较多的泡沫，也采用DCS系统自控补充消沫剂以保证发酵生产不逃液。

3.2种子罐接种

当种子罐罐温按规定时间达到工艺规定要求时，先关闭门窗与通风装置，并用0.25％洁尔灭溶液喷洒接种罐周围空间、禁止无关人员走动。用压差接种法接种：在种子罐上封头安装带阀门的不锈钢管，不锈钢管与竹节连接，该竹节在种子培养基消毒时包扎8层纱布，在消毒温度达到100℃以上时，微开阀门，有活蒸汽流出，消毒竹节等罐体接种装置。成熟种子并瓶入1000ml不锈钢接种瓶中，该接种瓶接入端由胶管连接，胶管移出端也包扎8层纱布；接种瓶的胶塞由压盖严格固定；并瓶结束后用无菌纱布包裹接种瓶竹节、压盖、胶塞。接种操作由一级罐消毒人员与化验室霉菌人员完成。消毒人员旋开罐体竹节包裹纱布绳、同时霉菌人员旋开胶管包裹纱布绳，迅速打开各自纱布、胶管迅即与罐体竹节对接、拧紧。消毒人员关种子罐排气，罐体与接种瓶内压力均上升，霉菌人员提高接种瓶、瓶口朝下，消毒人员开罐体排气，罐体与接种瓶压力均下降，种液接入种子罐内，如此反复3～4次，以在压力下降后，从视镜观察罐体内，再没有种子液流出为准。接种完毕，调整进、排气，使空气流量与罐压符合工艺要求，种子开始培养。

3.3培养基配制