鲎法测定细菌内毒素影响因素的研究进

鲎法测定细菌内毒素影响因素的研究进展

董培智（山西省药品检验所太原*********************）

鲎试剂法是利用鲎血细胞溶解物（Limulus Amebocyte Lysate, LAL;Tachypleus Amebocyte Lysate,TAL）与微量（pg/ml级）细菌(主要是革兰氏阴性细菌,G-)的内毒素反应,从而检出被检物中内毒素的一种生物体外检测新技术。因为其具有快速、简便、经济、灵敏度高、重现性好、一次可同时测几个样品等优点，自从一九六四年美国学者Levin 和Bang 发现此法以来[1]，鲎法正被日益广泛地应用于医药卫生、食品卫生、环境卫生、分子生物学、以及微生物学中。

鲎法大致可分为凝胶法（Gel-colt end point or Gel-colt method,Gelation Assay）、比浊法（Turbridimetric Assay）色原基质法（Chromogenic Substrate method）、以及免疫法（Immunology Assay）等。本文依据文献报道，总结了近年来国内外学者在用这些方法测定细菌内毒素时发现的一些影响因素及其消除方法的研究进展，以供试验者参考。

1 试验条件与操作

培养条件、操作环境可能引起各次实验之间、各实验室之间的结果差异[2]。

1.1 时间

鲎试剂在液态时极不稳定, 室温放置太久会影响反应灵敏度，故加样结束后,应立即放入恒温水浴中。[3]延长保温时间，可提高LAL的灵敏度。[4]

有研究者[5]发现细菌内毒素国家标准品和工作标准品的不同混合时间与相对活性之间具有一定的规律，即５分钟时混合点的活性最强，混合时间越长，活性反而降低，但在三十分钟以内的各混合点测定的灵敏度均在规定范围之内。

在显色法中灵敏度与时间有关，故实验过程中既要严格控制每个环节的保温时间，又要严格控制终止时间[2][6][7]。

1．2 温度

凝胶试验规定的孵化温度为37℃。但在夏季高温季节，如果同时作几个样，阳性对照不成立的现象时有发生，故应改为冰浴。[3]

郭录平[4]通过实验证明，保温在25-41℃内，随着温度的升高，LAL的灵敏度也随着升高；在41-46℃之间，对灵敏度无明显影响；≥48℃会破坏鲎试剂。

另外在显色法中的灵敏度也与控制温度有关[6][7]。

1.3 pH值

高国政等人[8]用动态浊度法详细研究了样品pH 值对细菌内毒素测定的影响，结果发

现：样品pH 在6-8间实验结果稳定；pH ≤3 或≥12时，实验受到抑制，平均回收率≤56.8%。最后得出结论：使用TAL 时，供试品pH 应预调在6.5-7.5 为好；使用LAL 时，pH 应预调在6.2±0.1或6.7-7.8为好。

也有人认为[4][7][9] 鲎试验的pH 应为6.5-8.5，以7.0-7.5为佳。必要时可用无内毒素的HCl 或NaOH 调节pH 值[2]。

1．4 试验器具

内毒素稀释不宜用注射器，而应用经过校正的刻度吸管。因为注射器刻度不准，而且,针栓壁磨沙面易吸附内毒素而使其浓度不够,造成凝胶反应不成立[3][10]。

普通玻璃及塑料管也会影响实验结果[2][9]，用硬的玻璃管及AR玻璃管较为合适。一般硼酸玻璃管测得的效价较低,而且LAL的灵敏度愈低，管对测定的结果影

响愈大。操作中常用的聚丙烯塑料管可能干扰结果。

1．5 操作程序

有实验者发现[3][11]：操作次序也影响试验结果。应该先吸取供试品、然后加入阴性对照及阳性对照液，最后按供试品管、阳性对照管、阴性对照的顺序逐一精确加入鲎试剂。未按此程序容易出现阳性反应不成立的现象。

1.6 处理作用

Pedersen MR和Hansen EW[12]将内毒素溶液用玻璃试管干燥，在氧丙环（Ethylene Oxide，EO）450或900mg/l中暴露1-46小时后，内毒素的LAL活性减少至百分之三十。将多粘菌素B（Polymyxin B，PB）加入到内毒素稀释液中会减少其活性百分之七十五。内毒素经过EO处理会减少LAL活性百分之七十，进一步加入PB会减少LAL的活性百分之九十九。EO对内毒素的反应会减少其LAL活性，也会减少其热源反应，增加与PB的亲和性。

Bamba T[13]等学者研究了平滑型G-细菌的内毒素（Smooth gram-negative bacteria ，S-form)经过高温蒸气处理后的灭活效果，观察到不同种细菌的抗热性显著地不同，减弱率与浓度有关。低浓度（10ng/ml）内毒素处理后的活性可降低至可测定的限度下。粗糙型（Rough strains，R-form)细菌的内毒素减弱时间曲线与个别平滑型相似。平滑型，尤其是Rc突变体（Rc mutant）细菌的内毒素灭活性能够被Mg2+，Ca2+等二价阳离子显著影响。

FDA认为不同的产品处理和储存条件可能会引起对某一样品试验的分析误差。Guilfoyle DE [14]等人通过实验发现培养细菌的培养基以及溶剂的储藏温度均不会引起任何问题。然而，因为溶液在瓶中没有充分震荡，溶剂与橡胶塞接触，约有百分之二十到四十的内毒素丢失。解决此问题的方法是应将试剂直立地存放在无污染的瓶中，并规定在内毒素试验之前统一的混合步骤。

姜素云等[15]通过考察细菌内毒素的稳定性后发现，溶解后的细菌内毒素应用液（0.5-1.0Eu/ml）在0-4 ℃放置一周活性不变；1.0-20Eu 应用液若置冰箱，可冷冻保藏20

天，但反复冻融活性会逐渐降低。

2 供试品

2.1 多糖[2]

我们已经知道每毫升含皮克级的内毒素会使鲎试剂呈阳性，而多于10pg/ml浓度的产碱杆菌多糖（1-3-β-D-葡聚糖）（curdlan，1-3-beta-D-glucan）也会使常规的内毒素实验呈阳性，因为LAL中含G因子[16]。

据报道[17][18]，能激活鲎试剂旁路（G 途径）的物质主要是（1-3）-β-D-葡聚糖（包括（1-4）-β-D-葡聚糖和（1-6）-β-D-葡聚糖）以及LAL-RM（LAL-Reaction Material）两类，如真菌多糖（Fugal polysaccharide）、中空纤维滤膜洗涤液、肾透析仪（人工肾，血液透析仪）洗涤液等。实验室常用的酒精，棉球等也含有较多的（1-3）-β-D-葡聚糖。低于一定浓度的（1-3）-β-D-葡聚糖或LAL-RM不

足以使鲎试剂的凝集反应产生阳性结果，但如果有细菌内毒素共同作用的情况下，凝集反应会变得更为激烈和迅速，很容易使反应出现阳性结果。我国已生产出含有能抑制或阻断鲎试剂G因子旁路反应物质的试剂—增抗液（Antienhancement Solution）。

Cooper JF 和Weary ME[19]等学者发现商品的LAL试剂对葡聚糖的反应存在很大的差异，所以实验室间LAL实验的结果可能出现矛盾。动态LAL方法（Kinetic LAL methods）对筛选可能被葡聚糖污染了的物质非常有用。葡聚糖在非口服制剂中不常见，只限于被微生物或纤维素物质污染的产品。并设计了一种能确定葡聚糖存在与否的LAL试验方法。

另外，丹麦科学家[20]发现，细菌内毒素与鲎试剂的凝集反应可被二甲亚砜与多粘菌素B（dimethyl sulfoxide and polymyxin B）合用,或抗鲎C因子的单克隆抗体（monoclonal antibody against Limulus factor C）所抑制。他们还发现β-葡聚糖（beta-glucan）激活途径能完全被昆布糖（laminarin）所阻碍，而不影响内毒素的激活途径。人血浆与LAL反应是通过β-葡聚糖途径激活的，而非内毒素途径。

八十年代后，日本最先研制成功只与内毒素起反应的特异鲎试剂，如：Endospecy，以及只与（1-3）-β-葡聚糖反应的鲎试剂：SLP试剂及Gluspecy。[21]

2.2蛋白

2.2.1阳离子蛋白

几位德国科学家[21]发现阳离子蛋白（Cationic proteins）如溶菌酶、核糖核酸酶A、以及人的免疫球蛋白G（lysozyme, ribonuclease A, and human IgG）能够与细菌内毒素形成细菌内毒素-蛋白复合体，对细菌内毒素有显著的屏蔽作用，从而影响用鲎法来测定细菌内毒素。试验证明，苯酚提取法、稀释加热法、以及高氯酸处理（phenol extraction, dilution heating, and perchloric acid treatment）等方法都不能够解除此作用。胰岛素、糜蛋白酶、链酶蛋白酶（trypsin, chymotrypsin, or pronase）等只能回收10%-20%的内毒素，然而如在测定之前，用蛋白酶K （proteinase K）来消化样品，可使细菌内毒素的回收率达到百分之百。进一步研究还发现，