红笛鲷NCCRP-1基因原核表达条件的优化及纯化

第30卷 第6期 广东海洋大学学报 V ol.30 No.6
2010年12月 Journal of Guangdong Ocean University Dec. 2010
收稿日期：2010-06-13
基金项目：国家自然科学基金“红笛鲷仔鱼抗菌免疫基因的克隆及表达时序研究”（40906073）
第一作者：魏世娜（1985－），女，硕士研究生，主要从事水产动物病害防治。

Email : weishinazi@ 通讯作者：简纪常，教授，主要从事水产动物免疫学及病害控制。

Email : jianjc@
红笛鲷NCCRP-1基因原核表达条件的优化及纯化
魏世娜，王 蓓，鲁义善，吴灶和，简纪常
（广东海洋大学水产学院，广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室暨广东省高等学校水产经济动物病害控制重点实验室,
广东 湛江 524025）
摘 要：通过克隆编码红笛鲷（Lutjanus sanguineus ）非特异性毒性细胞受体蛋白-1（nonspecific cytotoxic cell receptor protein-1, NCCRP-1）成熟肽基因序列，然后与载体连接构建pET21a-NCCRP 融合蛋白表达载体，将其转入大肠杆菌BL21进行诱导表达并优化条件。

SDS-PAGE 分析表明，在异丙基-β-D -硫代半乳糖苷（IPTG ）浓度0.8 mmol/L 、37 ℃条件下培养3 h 后表达量最大，
分子大小与预期值相符，融合蛋白主要以包涵体形式高效表达，通过HisTrap HP 柱子使其得到进一步纯化；Western blot 分析表明，该融合蛋白可与鼠抗His-tag 单克隆抗体发生特异性结合，说明获得该表达产物。

关键词：红笛鲷；NCCRP -1基因；原核表达；条件优化； 纯化
中图分类号：S942.1 + Q344+.13 文献标志码：
A 文章编号：1673-9159（2010）06-0025-06
Purification and Optimization of Prokaryotic Expression of Crimson
Snapper (Lutjanus sanguineus ) NCCRP-1 Gene
WEI Shi-na, WANG Bei, LU Yi-shan, WU Zao-he, JIAN Ji-chang
(Fisheries College of Guangdong Ocean University , Guangdong Provincial Key Laboratory of Pathogenic Biology and Epidemiology for Aquatic Economic Animals & Key Laboratory of Diseases Controlling for Aquatic Economic Animals of Guangdong Higher Education Institutions ,
Zhanjiang 524025, China )
Abstract ：The cloned mature peptide of Lutjanus sanguineus NCCRP-1 was connected with the expression vector pET-21a to construct fusion protein pET21a-NCCRP. This recombinant was transformed into Es cherichia coli BL21 and mainly expressed in the form of inclusion body. The optimal condition for the expression of this protein was that the cells were induced at 37 ℃, in 0.8 mmol/L of IPTG for 3 hours. The molecular weight of the expressed product was identical to that of expected protein by SDS-PAGE analysis, then purified by HisTrap HP column. The result of Western blot show that the expressed product could be combined with mouse anti-His-tag Mab. The fusion protein which lays the basic could be obtained for the future research on function and applied in fish innate immunity. Key words: Lutjanus sanguineus ；NCCRP-1 gene; conditions optimization; purification
红笛鲷（Lutjanus sanguineus ）又名红鱼，隶属鲈形目、笛鲷科、笛鲷属，是我国南方沿海的重要经济鱼类之一。

但是随着水产养殖集约化程度的不
断提高，鱼类病害所带来的损失愈发严重，严重制约水产养殖业的健康发展，而传统的化学药物的使用会引起病原体抗药性增加和药物残留等问题，因
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此有必要提高其免疫防御能力，而鱼类在病原刺激、环境突变等不利条件下，非特异性免疫起着至关重要的作用。

非特异性细胞毒性细胞（nonspecific cytotoxic cell, NCC）在鱼类先天性免疫反应中的细胞毒性效应机制中起重要作用[1-3]。

鱼类NCC主要来源于血液和淋巴器官，通过其细胞表面受体蛋白NCCRP-1（nonspecific cytotoxic cell recepor protein-1）识别靶细胞[4]。

NCCRP-1是一种Ⅲ型跨膜糖蛋白，具有胞外抗原结合域、胞内N端转录激活域及C端多种激酶磷酸化位点的信号域，因此，NCCRP-1在鱼类先天性免疫中的NCC毒性激活方面气了重要的作用。

目前国外已经克隆到虹鳟(Onchorhynchus mykiss)、鲤鱼(Cyprinus carpio L.) 、斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus)、大西洋鳕鱼（Gadus morhua L.）、尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）、金头鲷（Sparus aurata L.）等鱼类的NCCRP-1基因[5-10]，而对其功能研究仅局限于斑点差尾鮰和罗非鱼，国内还未见有关鱼类NCCRP-1基因的克隆及其蛋白纯化方面的报道。

本实验将已克隆到的红笛鲷头肾组织NCCRP-1基因成熟肽的编码序列（GenBank 登录号：GU075705）插入表达载体pET21a，转入大肠杆菌BL21，构建并优化了原核高效表达条件，并对该基因所表达的蛋白进行纯化，为其在鱼类先天性免疫中的功能及其应用研究奠定基础。

1 材料与方法
1.1材料
1.1.1载体和菌株大肠杆菌DH5α、BL21、质粒pET21a以及红笛鲷NCCRP-1基因（经测序鉴定无误）均为本实验室保存。

1.1.2主要试剂限制性核酸内切酶NdeⅠ和XhoⅠ、T4 DNA连接酶、Ex Taq DNA聚合酶、dNTP、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、氨苄青霉素、DNA Marker、低分子蛋白Marker及预染标准相对分子质量蛋白均为TaKaRa公司产品；鼠抗His-tag单抗、辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG 及DAB显色试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司、PVDF膜购自PALL公司；DNA胶回收试剂盒购自上海生工生物技术有限公司；其他试剂均为国产分析纯；PCR引物均由上海生工生物技术有限公司合成。

1.1.3仪器主要仪器有台式高速低温离心机（Sigma）、全温振荡培养箱（HZQ-F160，哈尔滨东联电子技术开发有限公司）、恒温摇床（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）、超声波细胞粉碎机（JY92-2D，宁波新芝生物科技股份有限公司）、凝胶图象分析仪（GDS-8000，美国Gene公司）、蛋白纯化柱HisTrap HP1mL预装柱（GE公司）、小垂直板电泳槽及Trans-Blot转印槽（美国Bio-Rad）等。

1.2方法
1.2.1NCCRP-1基因的克隆及重组表达质粒pET21a-NCCRP的构建与鉴定根据已获得NCCRP-1基因cDNA序列设计一对特异性引物，上游引物ProS为：5'-CCAACATATGTCTGCAGC TGAGTGGAAGAAG-3'（CATATG为NdeⅠ酶切位点）；下游引物ProA为：5'-CCGCTCGAGGGAGCT GGTTTTGGTTGGCTTG-3'（CTCGAG为XhoⅠ酶切位点）。

以实验室已测序正确的克隆载体pMD18T-NCCRP为模板，用含有酶切位点的特异性引物Pros、ProA进行PCR扩增，反应条件为：94 ℃下预变性5 min；94 30 s
℃，61 45 s
℃，72
℃60 s，共34个循环；再72 ℃下继续延伸10 min。

PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳检测后，回收目的片段。

PCR扩增产物和表达载体pET21a分别经NdeⅠ和XhoⅠ双酶切并回收酶切产物，用T4连接酶16 ℃下连接4 h以上，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态，挑取阳性菌落抽提质粒，进一步通过酶切和菌落PCR鉴定选择阳性克隆测序。

1.2.2 不同诱导时间对目的蛋白在大肠杆菌中表
达量的影响阳性克隆经测序鉴定正确后，提取pET21a-NCCRP质粒转化大肠杆菌BL21感受态；挑单克隆检测为阳性后，接种到2 mL含氨苄青霉素的LB培养基中，37 ℃下振荡培养（180 r/min）
4 h以上，按1∶50的比例接种到新鲜的同种液体培养基中扩大培养至生长对数期（约4 h），取1 mL 菌液作未诱导对照，其他加入IPTG至终浓度为1.0 mmol/L，于37 ℃继续振荡培养，分别于诱导1、2、3、4、5和6 h后各取1 mL菌液，以SDS-PAGE（浓缩胶浓度50 mg/mL，分离胶浓度12 mg/mL）分析目的蛋白表达量。

1.2.3不同浓度IPTG对目的蛋白在大肠杆菌中表
达量的影响按1.2.2培养细菌，取1 mL菌液作未诱导对照，分别加入不同体积的IPTG，使其终浓度分别为0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mmol/L，于37℃
继续剧烈振荡4 h 后各取1 mL 菌液，以SDS-PAGE 分析目的蛋白的表达量。

1.2.4 不同诱导温度对目的蛋白在大肠杆菌中表达量的影响 细菌培养情况如1.2.2，在IPTG 浓度为0.8 mmol/L 时，在37、28和16 ℃下诱导3 h 分别离心收集菌体并超声破碎，对离心后的上清和沉淀以SDS-PAGE 分析目的蛋白表达的最适条件。

1.2.5 目的蛋白的纯化及免疫印迹分析 将含重组质粒的BL21菌接种于1 000 mL 含氨苄青霉素的LB 培养基，经优化的诱导条件诱导后，离心收集菌体提取重组蛋白，用不同浓度的咪唑洗脱通过Histrap HP 柱纯化重组蛋白，最后将收集到的蛋白经SDS-PAGE ，确定最佳洗脱浓度。

将诱导前后的含空载体和NCCRP-1基因的表达菌总蛋白电泳后，用Mini Trans-Blot 配合Mini Protean Ⅲ电泳槽（Bio-Rad 公司）将已用电转液泡30 min 的胶块转移至硝酸纤维素膜上，用鼠抗His-tag 单抗与之反应，二抗为辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG ，各步骤之间用含体积分数0.1% Tween20的磷酸缓冲液（TBS ）洗膜4次，每次5 min ，最后用二氨基联苯胺（DAB ）显色至有清晰的目标蛋白带出现，用无菌水终止反应，并冲洗10 min 以终止显色，将膜置于滤纸上自然干燥。

2 结果与分析
2.1 NCCRP-1基因的克隆及表达载体的构建
克隆质粒pMD18T-NCCRP 用Nde /ⅠXho Ⅰ双酶切结果如图1所示，将扩增的NCCRP-1基因PCR 产物和质粒pET21a 分别酶切后由T4连接酶连接，构建的阳性质粒pET21a-NCCRP 双酶切结果如图2，以该质粒为模板，扩增出与预期结果715 bp 大小一致的特异性条带（图3），双向测序未发现NCCRP-1有错配或突变，证实重组表达质粒pET21a-NCCRP 构建成功。

2.2 重组红笛鲷NCCRP-1基因在大肠杆菌中的表
达分析
2.2.1 最佳诱导时间 将重组质粒pET21a-NCCRP 转化于BL21感受态细胞内，SDS-PAGE 电泳结果显示：经IPTG 诱导后，含pET21a-NCCRP 的大肠杆菌在大约32 000处出现一条明显的蛋白表达带，
但是诱导时间在3 h 以上对于目的蛋白表达量影响不显著（图4），所以确定重组蛋白最佳诱导时间是3 h 。

10 0008 0006 0005 0004 0003 0001 000
2 000
M
1
M, DL 10,000TM DNA 标准; 1, pMD18T-NCCRP/Nde Ⅰ+Xho Ⅰ
图1 重组质粒pMD18T-NCCRP 酶切鉴定 Fig.1 The determination of the recombinant plasmid
pMD18T-NCCRP by enzyme restriction
10 0008 0006 0005 0004 0003 0001 000
2 000
M
1
M, DL 10,000
TM
DNA 标准；1, pET21a-NCCRP/Nde Ⅰ+Xho Ⅰ
图2
重组质粒pET21a-NCCRP 酶切鉴定 Fig.2 Determination of the recombinant plasmid
pET21a-NCCRP by enzyme restriction
M 1
715 bp
500 bp 250 bp 100 bp
750 bp 1 000 bp 2 000 bp
M, DL 2000 DNA 标准; 1, 阳性克隆
图3 重组质粒pET21a-NCCRP 菌液PCR 鉴定
Fig.3 Identification of the recombinant plasmid
pET21a-NCCRP by clony PCR
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1
2
3
4
5
6
7
M, 低分子蛋白marker; 1, 未诱导的pET21a-NCCRP; 2-7, 分别为1 mmol/L IPTG 分别诱导pET21a-NCCRP/BL21的时间1, 2, 3, 4, 5和6 h M , low molecular protein marker; 1, expression of the pET-21a plasmid bacteria as the control; 2-7, total protein of pET21a-NCCRP recombinant bacteria after addition of IPTG for 1, 2, 3, 4, 5, 6 h respectively
图4 不同时间诱导表达的SDS-PAGE 分析
Fig.4 SDS-PAGE analysis of expression of pET21a-NCCRP
at different induced time
2.2.2 最佳诱导浓度 诱导剂IPTG 浓度在0.2 ~ 1.0 mmol/L 范围内，表达量随浓度的升高而增加（图5）。

由于诱导剂IPTG 对细胞有毒性，高浓度IPTG 不利于细菌生长，因此，以0.8 mmol/L 的IPTG 作为最佳诱导浓度。

2.2.3 最佳诱导温度 不同温度诱导下融合蛋白的可溶性分析表明，随着诱导温度的提高，37 ℃时重组蛋白的表达量最大，经超声裂解后，裂解液上清中检测到少量目的蛋白，不足以进行下一步纯化实验，而在沉淀中出现明显的蛋白条带（图6），则该表达的目的蛋白主要以包涵体形式表达。

2.2.4 重组菌在优化条件下表达目的蛋白的纯化及Western blot 分析 在最佳诱导条件0.8 mmol/L 的IPTG 浓度下，37 ℃下培养3 h 后（图7）。

将超声破碎后提取的包涵体上样到HisTrap HP 柱上，用不同咪唑浓度的缓冲液洗脱，通过SDS -PAGE 分析各浓度的收集物，最后确定50 mmol/L 的咪唑浓度洗脱效果最好，无杂蛋白（图8）。

从Western blot 结果（图9）可见，大肠杆菌BL21经IPTG 诱导后，出现明显的条带，该条带即为带有6×His -tag 的表达蛋白，大小与SDS -PAGE 中诱导后出现的条带吻合，结合测序结果可推断，已成功表达红笛鲷NCCRP-1。

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M
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M, 低分子蛋白marker; 1, 2: pET21a 诱导前后的全菌蛋白；3-7分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L IPTG 诱导的全菌蛋白
M , low molecular protein marker; 1, expression of the pET-21a plasmid bacteria as the control; 2, expression of the pET-21a plasmid bacteria with IPTG inducing; 3-7, total protein of pET21a-NCCRP recombinant bacteria after addition of IPTG for the concentration of 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 mmol/L respectively
图5 不同IPTG 浓度诱导表达的SDS-PAGE 分析 Fig.5 SDS-PAGE analysis of expression of pET21a-NCCRP
at different concentration of IPTG
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M, 低分子蛋白marker; 1、2、3分别为16、28、37 ℃诱导的全菌蛋白; 4-9分别为37、28、16 ℃超声裂解上清和超声裂解沉淀
M, low molecular protein marker; 1-3, total protein of induced pET21a-NCCRP recombinant bacteria under different temperature 16, 28, 37 ℃; 4-9, supernatant and precipitation of the pET21a-NCCRP recombinant bacteria under different temperature 37, 28, 16 ℃
图6 不同温度下融合蛋白表达情况分析
Fig.6 SDS-PAGE analysis of expression of pET21a-NCCRP
at different temperature
M
1
2
3
4
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M: 低分子蛋白marker; 1, 2: pET21a 诱导前后; 3, 4: pET21a-NCCRP 诱导前后
M, low molecular protein marker; 1, expression of the pET-21a plasmid bacteria as the control; 2, expression of the pET-21a plasmid bacteria with IPTG inducing; 3, total protein of uninduced pET21a-NCCRP recombinant bacteria; 4, total protein of induced pET21a-NCCRP recombinant bacteria
图7 pET21a-NCCRP 在大肠杆菌BL21中表达
Fig.7 SDS-PAGE analysis pET21a-NCCRP expressed in
E . coli BL21
M
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M, 低分子蛋白marker; 1, 诱导的pET21a-NCCRP; 2, 提取的pET21a-NCCRP 包涵体; 3, 纯化后的pET21a-NCCRP 包涵体
M, low molecular protein marker; 1, total protein of induced pET21a-NCCRP recombinant bacteria; 2, the inclusion bodies of pET21a-NCCRP; 3, pruified inclusion bodies of pET21a-NCCRP
图8
重组蛋白的纯化分析
Fig.8 SDS-PAGE analysis of the pET21a-NCCRP
fusion protein
M
1
2
3
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720005500034000
10000
4300026000
17000
M, 预染标准分子蛋白; 1, 未诱导pET21a 空菌; 2, 诱导 3 h 的
pET21a-NCCRP; 3, 纯化后的pET21a-NCCRP 包涵体
M, Prestained Protein marker; 1, expression of the pET-21a plasmid bacteria as the control; 2, total protein of the induced pET21a-NCCRP recombinant bacteria; 3, purified inclusion bodies of pET21a-NCCRP
图9 用His-Tag 单克隆抗体进行western blot 分析 Fig.9 Western blot analysis using His-Tag monoclonal
antibody
3 讨 论
本研究根据红笛鲷NCCRP -1基因的完整开放阅读框（ORF ）序列，选择pET21a 载体上合适的酶切位点，设计特异性异物扩增其成熟肽cDNA 片段，其中上游引物ProS 加入Nde Ⅰ酶切位点，其序列的起始3个碱基为ATG ，作为该基因表达时的起始密码子，下游引物ProA 的3′端没有加终止密码子，加入的酶切位点为Xho Ⅰ，翻译出来的NCCRP-1融合蛋白C 端可带上pET21a 载体上的6个组氨酸标记，通过HisTrap HP 柱，可以方便高效地从包涵体中分离得到纯度较高的NCCRP-1蛋白，为NCC 在鱼类先天性免疫中的功能及其应用研究奠定基础。

外源蛋白的表达水平不仅涉及宿主、载体和外源基因三者之间的关系，且受诱导条件的影响[11]。

本实验通过固定其他因子，对单个因子经过不同时间、不同浓度IPTG 和不同温度的诱导表达后，获得整体的优化。

按照IPTG 终浓度1.0 mmol/L ，培养4 h 进行蛋白的小量诱导与检测，在蛋白电泳图中的蛋白Marker 29 000 ~ 44 300间出现新增蛋白带，通过确
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定IPTG最低有效浓度，一方面可降低对大肠杆菌代谢的毒性作用，另一方面可减少诱导蛋白表达的费用，SDS-PAGE分析显示终浓度为0.8 mmol/L的IPTG 表达量最大，而加入诱导剂后，细菌基本停止生长，蛋白表达量达到高值，却因诱导时间过长蛋白不断降解而使产量减少，所以选择3 h为最佳诱导时间。

温度在诱导过程中除影响氧的溶解度外，还会加速或延缓酶的反应速率，影响蛋白的性质[12]，因此最佳诱导温度为37℃蛋白表达量最高。

综上所述，在IPTG浓度0.8 mmol/L、37℃下培养3 h后表达效果最佳，重组菌可获得大量表达，而未经IPTG诱导的重组菌和空载体未获表达，为重组蛋白的大量纯化提供可靠数据。

本研究表明，目的蛋白主要以包涵体形式存在于表达产物中。

包涵体的存在不利于融合蛋白的正确折叠，且复性较难，从而影响目的蛋白的纯化。

包涵体中一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、外膜蛋白ompC、ompF 和ompA等[13]，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等，难溶于水，只溶于尿素、盐酸胍等变性剂[14]。

初步纯化的包涵体，利用表达蛋白带有的His标签的特性，用HisTrap HP柱获得进一步纯化。

因融合蛋白含有His-tag，且T7启动子为强启动子，使NCCRP-1在大肠杆菌中的高效表达影响产物的正确空间构象，过量表达的折叠中间体之间特异性的错误聚合而产生的非折叠状态聚集体导致包涵体的形成，但包涵体在纯化过程中是否得到复性，是否需溶解复性才能回收正确折叠的重组蛋白还有待于进一步研究。

Western blot结果表明，所提取包涵体通过HisTrap HP柱纯化，得到的融合蛋白可与鼠抗His-tag单克隆抗体发生特异性结合，说明获得NCCRP-1融合蛋白的表达产物，这也是对融合标签的一个检测。

后续工作将制备兔抗NCCRP-1，检测其是否具有免疫原性，并进一步研究纯化的蛋白是否具有体外杀菌和杀伤肿瘤细胞作用。

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