细菌的形态学检查

怀化医专《微生物学检验》教案编号：3

第八章细菌形态学检查

形态学检查的目的：

①从形态上识别细菌，为细菌分类与鉴别的基础；

②了解被检标本中有无细菌；

③直接从标本中观察到某些细菌，可对少数疾病初步诊断（如结核，脑膜炎等）。

第一节显微镜（microscope）

一、普通光学显微镜

原理自然光的波长为0.4um；显微镜的最大分辨率为0.2um（前者的一半）；肉眼的分辨率为0.2mm，故放大1000倍，使0.2um放大到0.2mm。

二、暗视野显微镜

用暗视野聚光器，使反光镜反射过来的光线不能进入镜筒，视野变暗，

线从暗视野聚光器周围斜射到菌体上，由于散射作用使菌体发光。

常用于活的微生物的动力检测。

三、相差显微镜

在检查不染色标本时，由于细菌的折光性与周围环境的折光性相近，对比不明显，看不清细菌及其内部结构，相差显微镜利用相差板的光栅作用，使光波穿过标本中密度不同的部位时，引起位相差，显出光的强度的明暗对比。

应用于活菌的形态及某些内部结构的观察。

四、荧光显微镜

以紫外光或蓝紫光作光源，因其波长比自然光短，故分辨率比普通显微镜要高。细菌经过荧光素染色后，在荧光显微镜下，由于菌体各种结构对荧光素的溶解、吸附情况不同，因此发出不同色调和亮度的荧光。

五、电子显微镜

以强大的电子流代替光源，因电子流的波长仅为0.005nm，（仅为可见光源的几万分之一），故其放大倍数可达10万-100万倍，可看清1nm的物体。电镜种类

透射电镜：因电子的透射作用，可观察细菌，virus内部结构，通过荧屏显

示。

扫描电镜：因电子流对物体的表面进行扫描，可清楚的显露出物体的三维空间的立体结构，可用于对细菌，virus的表面结构观察。

第二节不染色细菌标本检查法

仅用于细菌动力的观察。不能观察细菌的形态和结构特征。

1.压滴法明视野法、暗视野法。

2.悬滴法

3.毛细管法：孔径0.5-1.0mm，长约60-70mm毛细管，以此管轻取细菌培养物，待液体进入后，两端火焰封融。用于厌氧菌的动力观察。

注意：区别细菌的运动与布朗运动。

第三节细菌染色标本的检查

适于观察细菌的形态和某些结构。

一、染料：

大多是人工合成的含苯环或苯的有机物。

色基：即连接在苯环上带双键的有色化学基团，它使染料带颜色，其色基越多，颜色越深。如-NO2(硝基）\ -N=N-（偶氮基）

助色基：不显色，它决定了染料与被染物之间的亲和性，且有酸、碱之分，决定了染料的酸碱性：-NH2（碱性）-OH （酸性）

常用染料种类：

1、碱性染料：美兰，结晶紫，碱性复红等，常以氯化物形式存在，色基带正电，易与带负电的被染物结合着色。由于细菌PI低（2～5），因此常带负电荷，易与该类染料结合。

2、酸性染料：伊红，酸性复红，刚果红，色基带负电。细菌带负电荷不易着色，常用于细胞浆染色，很少用于细菌染色。

3、复合染料（中性染料）：是碱性染料和酸性染料的复合物，可与cell浆结合，如：伊红美兰、伊红天青。

4、单纯染料：多为偶氮化合物，亲和力低，不溶于水，而溶于脂溶剂。常用于脂肪组织染色，如：苏丹染料。

二、染色程序：

基本步骤：涂片（干燥）→固定→染色（初染、煤染、脱色、复染）

1、涂片制备：

液体标本（细菌培养液）直接涂于玻片上；

固体培养基上的培养物，取生理盐水涂片，涂成蚕豆大小的菌膜。

2、固定：

目的：①杀死细菌，使蛋白质凝固，易于着色；

②改变其通透性，利于染料进入；

③使菌体附着在玻片上；

④保持细菌原有的形态、结构。

方法：常用的火焰加热固定法，其它有：冷冻干燥法，化学干燥法。

3、染色：

（1）初染

（2）媒染

目的：加固初染——增加染料与被染物的亲和力、使染料固定于被染物、使细胞膜通透性改变。

媒染剂：石炭酸，碘液，明矾，酚等，也可用加热法。

（3）脱色

目的：使不该染上颜色的部分脱下颜色。

脱色剂：凡能使已经着色的被染物脱去颜色的化学试剂。酸（为碱的脱色剂），碱（为酸的脱色剂），还有甲醇，乙醇等，无机酸脱色能力强于有机酸，醇类中分子量小的强于分子量大的。

脱色机制：有的起溶媒作用（如醇类），有的影响蛋白质的电离程度，改变其电荷的性质或数量，从而影响细菌与染料结合的程度（如酸碱）。

（4）复染（对比染色）

常用染料：稀释复红、沙黄（与紫色对比）、美兰、苦味液（与红色对比）

三、常用的染色法

（一）单染法：

用一种染料染，细菌及周围部分都染成同一种颜色主要用于观察细菌的形

态、大小、排列及简单的结构，如美兰染色，复红染色。

（二）复染法：

用两种以上的染料，将不同的细菌或同一细菌的不同结构染成不同的颜色。可用于细菌的鉴别。常用的有——

1. 革兰染色法（Gram stain):

由丹麦细菌学家Christain Gram首创，已有100多年的历史。

染料：结晶紫、卢戈氏碘液、95%酒精、稀释石炭酸复红。

原理：

（1）等电点学说：革兰阳性菌ph2-3,低于革兰阴性菌ph4-5。与带正电荷的染料结合牢固。

（2）化学学说：革兰阳性菌含大量核糖核酸镁盐，与结晶紫和碘结合成大分子复合物而不易被脱色。

（3）通透性学说：革兰阳性菌cell wall因肽聚糖厚，脂类少，通透性低，酒精不易进入脱色，相反革兰阴性菌肽聚糖少，含脂多，易被酒精溶解，使cell wall通透性升高。

方法：略（实验课介绍）

结果：G+菌：紫色；G-菌：红色

意义：（1）鉴别细菌；（2）选择药物参考；（3）与致病性有关。

2. 抗酸染色（acid-fast stain）

原理：分枝杆菌一般不易着色，若用5%石炭酸复红加温并延长染色时间，可染上红色，又因其菌体中含有分枝菌酸，可抵抗3%盐酸酒精的脱色，仍保持红色，故称为抗酸菌。

方法：涂片、干燥、固定→石炭酸复红（初染）加热至冒蒸汽5min →

盐酸酒精脱色→碱性美兰（复染）1min

结果、意义：

3、特殊染色法

（1）细胞壁染色：

染液：10％鞣酸溶液、0.5％结晶紫溶液

方法：涂片自然干燥→鞣酸染15min，水洗→结晶紫染3~5min，水洗→待干，镜检。

结果：细胞壁（细菌的周边）染成紫色，内部无色；