2核酸的制备与提取

核酸的一级结构是指核酸分子中各核苷酸残基以磷酸 二酯键连接、沿多核苷酸链排列的顺序。
核苷酸的组成与连接
DNA的 一 级 结 构 图 示
（二）一级结构的表示方法
（1）线条式：竖线碳链、碱基、磷酸
A 3' P 5' P 5' C 3' P 5' G 3' P 5' T 3' P
（2）文字式：
5＇pＡpＣpＴpＴpＧpＡpＡpＣpＧ3＇DNA 5＇pＡpＣpＵpＵpＧpＡpＡpＣpＧ3＇RNA 此式可进一步简化为： 5＇ＡＣＴＴＧＡＡＣＧ3＇ 5＇ＡＣＵＵＧＡＡＣＧ3＇
第五节
核酸的保存与鉴定
第一节 核酸分离纯化的设计及原则
1、保持核酸分子结构的完整性；
2、尽量清除其它分子的污染，保证核酸纯度；
应尽量简化分离纯化步骤，缩短提取时间 尽量避免各种有害因素对核酸的破坏
一、核酸分子提取的技术路线
I.材料准备
II.破碎细胞或包膜－内容物释放
III.核酸分离、纯化
IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质
（二）、RNA结构的特点
RNA与DNA结构十分相似，二者相比有几点不同：
（1）核糖：
（2）碱基：A、 G、 C、 U （3）二者在三维结构上的区别——RNA不具有规则的氢 键结构，单链形式存在，只是回折，局部配对，不配对 形成突环。
1、mRNA
5‘Cap的功能：
3’ Poly A 的功能：
2、tRNA：转运氨基酸
F.Miescher

核酸作为遗传物质的发現过程

20世纪初，德国生理学家柯塞尔(Kossel)证实了核酸是 由四种不同的碱基所组成；美国科学家列文(Levene) 又确定了核酸有两种,即DNA和RNA；

1928英国科学家格里菲斯 (Griffith)利用细菌的性狀转 变实验，证明了遗传信息的可传递性；
3．细菌的裂解
碱裂解法 煮沸法
方法
--- 不适宜含糖高的菌株如HB101 --- 适用于大质粒DNA
SDS裂解法
Triton-溶菌酶法
4．质粒DNA的提取
第四节
真核细胞RNA的分离纯化
一、RNA制备的条件与环境

选择性地使用RNase的变性剂（如酚、氯仿及强烈的胍 类变性剂）


二、DNA的二级结构
（1）、模型建立的依据： Chargaff等科学家用纸层析及紫外分光光度技术 分析了各种生物的DNA的碱基组成。结果显示： 摩尔数 A=T；G=C；A+C=G+T； A+G=C+T
腺嘌呤
胸腺嘧啶
碱 基 之 间 形 成 氢 键 模 型
胞嘧啶
鸟嘌呤
双螺旋平面图
The double helix maintains a constant width because purines always face pyrimidines in the complementary A-T and G-C base pairs. The sequence in the figure is T-A, CG, A-T, G-C.


核仁小分子RNA (snoRNA) 负责rRNA加工(切割和修饰)由 内含子编码。

染色质RNA (chromosome RNA), 稳定基因组DNA的作用。
第二章、核酸分离技术
第一节 第二节 第三节 第四节 核酸分离纯化的设计及原则 基因组DNA的分离纯化 质粒DNA的提取与纯化 RNA的分离纯化

质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要媒
介物，这种基因运载工具在基因工程中具有极广泛的
应用价值，而质粒的分离与提取则是最常用、最基本 的实验技术。
质粒特性
1. 分子相对小 2. 含有高效的自主复制成分 3. 不相容性 4. 转移性 5. 选择的标记 6. 限制性内切酶单一切。
质粒DNA的提取和纯化
（二）、核酸的分布：
1、DNA的分布：
真核生物细胞核，线粒体亦含有DNA. 原核生物集中于核区，核外的质粒 病毒含有DNA或RNA.
2、RNA的分布
存在于细胞质和细胞核中。 发现了许多新的具有特殊功能的RNA： 如反义RNA，核酶等. 病毒和亚病毒RNA有许多种：正链RNA、负链RNA病毒、 类病毒、卫星病毒等 .
1．细菌的培养 先分离单个菌落，接种 到含少量适当抗生素的 培养基中扩增，随着细 菌的生长，质粒DNA也
质粒DNA的小量制备
质粒DNA的大量制备
在自主复制。
{
2-5ml
500ml
2．细菌的收集

细胞生长过程中，排出大 量代谢产物，为了提高质
粒DNA的纯度，离心弃上
清，细菌沉淀最好用STE 或生理盐水悬浮，漂洗l2次，离心管壁上的液体 也应该仔细去除干净
1944美国科学家艾佛瑞(Avery )证实了DNA造成细菌 性狀转变的物质基础； 1952美国科学家赫雪(Heishey)和蔡斯(Chase )证明遗 传物质是DNA非蛋白质； 1953年，英国科学家沃森和克里克发现了DNA的双螺 旋结构；



第二节、核酸的组成
一 核酸的概念和重要性
(一)概念
时，其它的核酸分子皆为杂质；
3、加入的有机溶剂和某些金属离子
二、技术路线的设计
（三）核酸的浓缩、沉淀与洗涤

沉淀是浓缩核酸的最常用的方法
常用的盐类有醋酸钠、醋酸钾、醋酸铵、氯化钠、
氯化钾及氯化镁

常用的有机溶剂则为乙醇、异丙醇和聚乙二醇

核酸沉淀常常含有少量共沉淀的盐，需用70%～
75%的乙醇洗涤去除
V.核酸溶解在适量缓冲液或水中
（一）核酸的释放
高速组织捣碎机
机械法
细胞破碎的方法 物理法
化学法
玻璃匀浆器 研钵 超声匀浆器 冻融法 自溶法 酶处理 表面活性剂处理法
（二）核酸的分离与纯化：
应该清除的杂质主要包括三部分
1、非核酸的大分子污染物：蛋白质、多糖及脂类 物质等 2、非需要的核酸分子：分离某一特定的核酸分子
核酸的提取过程
破碎细胞
核酸从细胞中游离出来 酚和氯仿 沉淀核酸 除去蛋白质 乙醇
第二节
真核基因组DNA的分离纯化
基因组DNA的特点：
1. 分子大，容易断裂
2.容易污染其它来源的DNA
分离纯化方法：
1.酚抽提法
2.甲酰胺解聚法 3.玻棒缠绕法 4.异丙醇沉淀法
一、酚抽提法
DNA酚抽提法示意图
基因组DNA的提取 --- 酚抽提法
三、DNA的三级、四级结构：
细长的分子以一种高度压缩状态存在于细胞中，双 螺旋的进一步扭曲就构成了三级结构。 超螺旋，三级结构中的一种。 DNA压缩总原则：多级螺旋，4级压缩。
原核
真核
基因A
基因区间 基因B
四、RNA分子的结构与功能
（一）、RNA的类别
1 信使RNA (messenger RNA, mRNA); 2 转移RNA (transfer RNA , tRNA); 3 核糖体RNA (ribosomal RNA , rRNA);
样品的准备 细胞的裂解
蛋白质变性
DNA的抽提
DNA的沉淀
血基因组DNA试剂盒
细菌基因组DNA试剂盒
酵母基因组DNA试剂盒
细胞基因组DNA试剂盒
DNA柱层析法示意图
第三节 质粒DNA的提取与纯化

质粒是细菌内独立于染色体并能自我复制的小环状
DNA分子其大小范围从lkb至200kb以上不等已经在形 形色色的细菌类群中发现质粒这些质粒都是独立于细 菌染色体之外进行复制和遗传的辅助性遗传单位。
由核苷酸或脱氧核苷酸通过3′，5′-磷酸二酯键连接而 成的一类生物大分子，具有非常重要的生物功能，主要 是贮存遗传信息和传递遗传信息。包括核糖核酸(RNA)和 脱氧核糖核酸(DNA)两类。 (二)重要性 1.与生命活动关系密切，是重要的生命物质。生命的起源、 生长、发育、衰老、死亡与之有关。 2.核酸研究是现代生物医学研究的核心。
基本组成单位
核糖核苷酸
磷酸
碱基： A、 G、C 、 U 磷酸
核糖 碱基 G U C A
主要在细胞质中
尿嘧啶 核糖核苷酸 胞嘧啶 鸟嘌呤 腺嘌呤
第三节、核酸的结构
一、核酸的一级结构
（一）核酸中核苷酸的连接方式 DNA、RNA中的脱氧核苷酸、核苷酸是通过3‘，5‘ – 磷酸二酯键连接的。 表示方法：书写顺序5‘——3’。
（2）DN来自百度文库双螺旋的特点：
A、两条反平行多核苷酸链绕中心 轴缠绕，右手螺旋； B、骨架：内侧碱基垂直于纵轴； 外侧-磷酸与戊糖、彼此通过3’、 5’磷酸二酯键，糖环平面与纵轴 平行。 大沟宽1.2nm，深0.85nm； 小沟宽0.6nm，深0.75nm； C、直径：2nm，二相邻碱基高度 0.34nm，二核苷酸夹角36度， 旋转一周10个核苷酸，一周高 度3.4nm；
（三） 核酸的组成
1. 组成的基本单位: 核苷酸 2. 组成元素:C 、 H 、 O 、 N 、 P
（1）核酸中的糖
RNA为D-核糖，DNA为 D-2-脱氧核糖，二者都 是β 型。差别：2 位羟基是否脱氧。
（2）碱基：
a、嘌呤碱：腺嘌呤（Ade)、鸟嘌呤(Gua) b、嘧啶碱：胞嘧啶(Cyt)、尿嘧啶(Ura)、胸腺嘧 啶(Thy)
Ala 的 tRNA 结 构 示 意 图
•tRNA有“接头” (adaptor)功能，具备双重 特性； •识别氨基酸——其 3’末端 的腺苷酸可与一氨基酸共 价连接 •识别密码子——反密码子 与mRNA中的密码子碱基 配对。
6、rRNA
rRNA 占 RNA 总 量 的 80% 以上，核糖体由大小两 个亚基组成，大小亚基 分别几种rRNA和数十种 蛋白质组成。 rRNA与几十种蛋白质组成 的细胞颗粒——核糖体 是细胞内合成蛋白质的 工厂。核糖体上催化肽 键合成的是rRNA，蛋白 质只是维持rRNA的构象， 起辅助作用。
核酸的分离与鉴定
王宏伟 南京大学医学院
Email: hwang@nju.edu.cn
学习内容
第一部份、核酸的基本知识；
第二部份、常用核酸制备方法；
第一部份、核酸的基本知识
第一节 第二节
核酸的研究历史； 核酸的化学组成；
第三节
核酸的结构特点；
第一节、核酸的发现

1868年瑞士科学家米 歇尔(F.Miescher)发現 细胞核內含高量磷的 酸性物质，命名为核 素(后改名为核酸) 早期的研究仅将核酸 看成是细胞中的一般 化学成分，没有人注 意到它在生物体内有 什么功能；
一切生物的遗传物质——核酸
五碳糖：脱氧核糖
脱氧核糖 核酸 （DNA）
基本组成单位
脱氧核糖 核苷酸
磷酸
碱基： A、 G、C 、 T 磷酸
脱氧 核糖 碱基 G C A T
核酸
主要在细胞核的染 色体上，少数在线 粒体和叶绿体
胸腺嘧啶 脱氧核糖核苷酸 胞嘧啶 鸟嘌呤 腺嘌呤
五碳糖：核糖
核糖核酸 （RNA）
二、 核酸的类别、分布和组成
（一）、类别： 核 酸 (nucleic acid) 分 为 : 脱 氧 核 糖 核 酸 (DNA, deoxyribonucleic acid ) 与 核 糖 核 酸 (RNA, ribonucleic acid )。 核糖核酸（RNA）分成以下几类： 1、信使RNA（mRNA） 2、转移RNA（tRNA） 3、核糖体RNA（rRNA） 4、其他的非编码RNA (snRNA, microRNA)
1、DNA的一级结构

DNA的一级结构A、T、G、C通过3`，5`-磷酸二酯键连接，C’1— 碱基，C’2——脱氧。
碱基：A、T、G、C；脱氧核糖；没有侧链

2 、一级结构特点


DNA的相对分子量非常大，能编码的信息量十分巨大。 细菌的基因是连续的,无内含子功能相关基因组成操纵子，有共同 的调控序列，较少重复序列。 真核生物的基因是断裂的，有内含子功能相关基因不组成操纵子， 调控序列占比重大，有较大重复序列,又分为高度重复、中度重复、 单一序列。此外还有回文结构. 越是高等的真核生物其调控序列和重复序列的比例越大。
场所：细胞核 转录
翻译
场所：核糖体
其他RNA的结构与功能

不均一核内RNA (heterogeneous nuclear RNA,hnRNA)： hnRNA是mRNA的未成熟前体。
细胞内有小核RNA (small nuclearRNA，snRNA)。它是 真核生物转录后加工过程中RNA剪接体(spilceosome)的主 要成分，参与mRNA前体的加工过程。
（3）核苷：

戊糖与碱基通过β-糖苷 键相连，C—N糖苷键。
糖C1 与嘧啶碱N1 与嘌呤 碱N9 相连，碱基与糖环 垂直。 根据核苷中所含戊糖的 不同，分为核糖核苷和 脱氧核糖核苷。 核酸分子中的碱基或核 苷酸的修饰非常常见， 如DNA的甲基化，RNA 的转录后修饰。



（4）核苷酸
酯键
碱基相连（核苷）