用于免疫分析的激光激发荧光光谱测量系统

用于免疫分析的激光激发荧光光谱测量系统

郭明磊1 章毛连 2

(1.安徽科技学院理学院,安徽 凤阳 233100 ；2.中国科学院等离子体物理研究所，合肥230031.) 摘要：阐述了镧系稀土铕离子螯合物的光谱特性及用于荧光免疫分析的可行性，依据稀土荧光螯合物的光学基本参数,建立了用于免疫分析的激光激发荧光光谱测量系统，并进行了相关的荧光光谱和荧光寿命测量实验。该系统以紫外氮分子激光器作为激发光源，实现样品的高强度激发；通过光学系统的设计和时间分辨技术，排除杂散光与本底光的干扰；采用光电倍增管接收微弱荧光信号，以 boxcar 脉冲取样技术实现数据采集，大大提高了检测的灵敏度。对于激光技术及荧光光谱技术在生物学方面的开发利用具有重要意义。

关键词：稀土离子螯合物 时间分辨 激光激发 荧光光谱

中图分类号：O657.319 ； O614.33 文 献 标 识 码 A

0 引言

随着激光技术、光谱技术、计算机技术以及荧光标记技术的飞速发展，结合多个学科，探索光子学技术在生物分子研究及医学诊断与治疗中的应用，已成为国际上迅速发展的领域。激光光源与普通光源相比有许多优异特性，它单色性好，相干性好，方向性强，亮度高，使得激光技术在生物学及医学领域的应用备受关注。在近紫外激光的激发下，稀土离子( 3 +

Eu ， 3 +

Sm ， 3 +Dy ， 3 +

Tb )螯合物发出特征荧光，且具有量子产率高、Stocks 位移大、发射峰窄、激发和发射波长理想、荧光寿命长（10～1000us ）等特点。因此稀士离子螯合物可以用来作为免疫分析的荧光标记物，通过测定它的荧光光谱强度 ，间接测定抗原抗体反应后复合物的相应量，从而达到定量检测的目的。Diamandis 等[1]建立直接固相镧系荧光分析方法，它以4，7-二氯磺基苯-1，10啡啰晽-2，9二羧酸（BCPDA ）为螯合剂，制备稀土标记免疫复合物。BCPDA 分子结构具有增强荧光作用，可直接检测稀土标记免疫复合物的荧光。这不仅操作简便，更重要的是克服了稀土外源污染，分析灵敏度也大大增强，成为目前无放射污染的高灵敏度的且最有发展前途的免疫分析方法。潘利华等[2 -4]，利用自主合成的稀士离子螯合剂，通过铕、镝、钐、铽的时间分辨荧光光谱分析，进行抗原抗体(如乙型肝炎、丙型肝炎)的检测，证实所合成的螯合剂能准确地进行荧光免疫分析。郭周义等[5]，对稀士离子螯合物荧光光谱及发光机制进行了研究，认为激发配体通过分子内能能量传递，将受激能量传递给稀土中心离子，接着发出稀土离子特征荧光，稀土

离子螯合物的荧光强度通常取决于配体与稀土离子间能量传递 [35]

。关于激光激发荧光光谱的研究可应用于定性、定量、定位的实时荧光检测，为基础医学、临床诊断提供理论依据和实验技术；并可以与显微成像技术结合进行荧光寿命影像研究[6-8]，研究生物分子、细胞、分子间的相互作用，对分子生物学、现代生物分析技术研究具有重要意义。

1.实验原理

将待测血样加入到抗体固相表面上，经过第一次温育，形成抗原抗体复合物，进行洗涤后，除去未反应的待测抗原。加入用稀士铕离子标记的螯合抗体，经过第二次温育后，形成抗原－抗体－稀士离子螯合物抗体复合物。制备过程如图1.

S o l i d p h a s e

Antigen

E u

u

S o l i d p h a s e

图1. 抗原－抗体－稀士离子螯合物抗体复合物的制备

投稿日期：2007-7-20

作者简介：郭明磊（1980-）男，硕士，教师，从事激光技术应用及激光生物学方面研究. Email:Guoml99@.

抗原－抗体－稀士离子螯合物抗体复合物在近紫外激光光源的照射下，先由配体吸收辐射能，从单重态的基态S 。跃迁至激发态1S ，其激发能以辐射方式回到基态S 。(产生配体荧光)，也可以非辐射方式传递给三重态的激发态1T 或2T 。三重态的激发能也可以辐射方式失去能量，回到基态(产生磷光)，或以非辐射方式将能量转移给稀土阳离子。激发态的稀土离子的能量跃迁也有两种方式，以非辐射方式或辐射方式跃迁到较低能态，再至基态，或以辐射方式跃迁到较低能态，此时就产生荧光。整个过程如图2(a).

Internal

S 0

S 0

S

550

600

650

700

750

7

F 4

7

F 3

7

F 2

7

F 1

7

F 0

Wavelength (nm)

图2.(a)铕离子螯合物能级跃迁 图2.(b) 铕离子螯合物荧光光谱图

稀土离子在近紫外区的吸收系数很小，发光效率较低，但是由于有机配体在近紫外区的吸收较强，并能有效地把激发能量通过无辐射跃迁转移给稀土阳离子，从而敏化稀土离子发光，弥补了稀土离子在近紫外区吸收系数很小的缺陷，这种配体敏稀土阳离子的发光效应称为Antenna 效应（即光吸收-能量转移-发射过程）。通过选择合适的配体可以控制非辐射衰减，增强光吸收的强度，从而提高稀土离子螯合物的发光效率。

3Eu +荧光谱一般为50D -7J F (J = 0，1, 2, 3, 4，5,),的跃迁光谱，是由稀土离子电子结构的内部

电子跃迁决定的，不受配体的影响。5700D F →，5701

D F →，5702D F →

，5703D F →，57

04D F →各电子跃迁对应的峰位置如图2(b)。用铕离子螯合物作为免疫分析的荧光标记物，建立起待测抗原量与铕离子的一一对应关系，通过测定铕离子的荧光光谱强度 ，间接测定抗原的相应量，从而达到定量检测的目的。

2.测量系统

所建的荧光光谱测量系统由激发光源、光路系统和光电检测系统三个部分组成。如图3.

图3.激光激发荧光光谱测量系统