基因工程第3章 基因克隆载体(1质粒载体)

诱导物：IPTG
• IPTG是乳糖的类似物。能诱导lac操纵 子的启动转录，使受体菌基因组中的 lacZ 的C端部分和载体的lacZ’肽都 表达。从而互补。 • 但载体MCS上插入外源DNA后，不能 产生肽！
lacZ的肽互补
• -肽（ lacZ’ 基因编码）：-半乳糖苷酶N端 的一段氨基酸片断（11-41氨基酸）。 • lacZ只有在4聚体的状态下才有功能。 • pUC质粒载体上的lacZ’ 编码的肽与这个缺 失突变的-半乳糖苷酶“互补”，使它能形 成4聚体，又能分解Xgal，产生蓝色物质。
• pBR322质粒是按照标准的质粒载体命 名法则命名的。
• “p”表示它是一种质粒； • “BR”则是分别取自该质粒的两位主 要构建者F．Bo1ivar和 R．L．Rodriguez姓氏的头一个字母， • “322'’系指实验室编号，以与其他质 粒载体如pBR325，pBR327， pBR328等相区别。
合适的启动子
• 真核生物基因在原核生物中表达，改 用原核生物或病毒（噬菌体）基因的 启动子。
• 原核生物基因在真核生物中表达，仍 用原核生物基因的启动子。 • 选用外界条件诱导的启动子。
(1) 质粒克隆载体pBR322
• pBR322是经人 工改造的一种较 为理想的大肠杆 菌质粒载体，应 用广泛。现在已 经被许多更优良 的新型克隆载体 所替代。 (P40)
• （1）分子量大，拷贝数低
• 第一个用于基因克隆的天然质粒pSC101，分子 长 9.1 kb。但只有一个EcoR I切点充当克隆位点， Tetr 作为筛选标志。
（2）筛选标志不理想
• ColE1质粒的筛选标志是大肠杆菌素E1 （colicin E1）。 • colicin E1能杀死不含ColE1 质粒的菌，形 成“噬菌斑”。 • 唯一的克隆位点 EcoR I 正好位于这个基因 的内部。因此可通过插入失活筛选。但细 菌群体容易自发突变出抗colicin E1的细 胞…….
IPTG诱导的结果：蓝白斑筛选
• MCS无插入时，互补，蓝菌斑。 • MCS有插入时，不互补，白菌斑（教材P94）
通过看培养皿上的菌斑的颜色就能直接知道 是否有DNA插入。
IPTG诱导的结果：
1、具有更小的分子量和更高的拷贝数。 2、适用于组织化学方法检测重组体。
质粒克隆载体引入lacZ’互补的E.coli，在含IPTG 和X－gal 的诱导培养基中，菌落呈蓝色。 如果在MCS区插入一个外源片断，就会使lacZ’基 因失活，引入 lacZ’互补的E.coli，在含IPTG 和X－ gal 的诱导培养基中，菌落呈白色。
• 质粒克隆载体引入与lacZ’互补的E.coli， 在含IPTG和X－gal的诱导培养基中，菌落 呈蓝色。 • 如果在MCS区插入一个外源片断，就会使 lacZ’基因失活，引入 lacZ’互补的E.coli， 肽不能生成，就无所谓互补，在含IPTG 和X－gal的诱导培养基中X－gal不会被降 解，菌落呈白色。
• 两种含有相似复制子结构的不同质粒， 在复制时受到同一种拷贝数控制系统 的干扰，致使两种质粒的最终拷贝数 不同，其中拷贝数多的质粒在以后的 细胞分裂周期中更具优势。
一、 质粒载体
• 质粒克隆载体是以质粒DNA分子为基础构 建而成的克隆载体。
天然质粒的缺陷
• 天然存在的野生型质粒由于分子量大、 拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标 记不理想等缺陷，不能满足克隆载体 的要求，因此往往需要以多种野生型 质粒为基础进行人工构建。
质粒的基本生物学特征
• 生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体 而自主复制、并稳定遗传的一类核酸分子 • 常见于原核细菌和真菌中 • 绝大多数的是DNA型（除了酵母的杀伤质 粒（killer plasmid）是一种RNA质粒外） • 绝大多数具有共价、封闭、环状的分子结 构，即cccDNA • 分子量范围：1－300kb，多数在10kb • 某些蓝藻、真菌和绿藻中也有发现
3.3 质粒克隆载体的构建 (P39)
• • • • • 选择合适的出发质粒 正确获得构建质粒克隆载体的元件 组装合适的选择标记基因 选用合适的启动子 构建过程力求简单
出发质粒含有质粒克隆载体必备的元件： 复制起始位点 克隆位点 选择标记基因 启动子和终止子
出发质粒（亲本质粒）
亲本质粒必须含有质粒克隆载体必备的元件： • 复制起始位点 • 选择标记基因 • 克隆位点 • 启动子和终止子
质粒的存在形式：
• 开环DNA分子(oc-DNA) • 线性DNA分子(l-DNA) • 超螺旋DNA分子(scDNA)
• 同一质粒尽管分子量相同，不同 的构型电泳迁移率不同： • scDNA最快、l DNA次之、 ocDNA最慢。
• 共价闭合环状DNA分子(ccc-DNA)
质粒DNA的复制
• 质粒拷贝数即一个细胞内质粒的数量与染色 体数量之比。每种质粒在相应的宿主细胞内 保持相对稳定的拷贝数。 • 根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡， 质粒可分为两大复制类型：
3.2 构建质粒克隆载体的基本策略
1. 能在受体中进行有效的复制（有复制起始位点）。
2. 含多克隆位点 3. 含有供选择克隆子的标记基因，如：常用的标记 基因：Apr，Kmr，Smr， Tcr基因等 4. DNA分子尽可能小和较高的拷贝数。 5. 根据特殊需要，组装各种“元件”，构建不同用 途的质粒克隆载体。 理想的载体应该有两种抗菌素抗性基因。
严谨型质粒：分子量大，低拷贝数，1－3拷贝
松弛型质粒：分子量小，高拷贝数，10－60拷贝 P38
质粒的不相容性（P39）
• 在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系 密切的不同质粒，不能在同一宿主细胞内 稳定的共存。
不相容性质粒：不能共存于同一细胞内不同质粒
相容性质粒：共存于同一细胞内不同质粒
质粒的不相容性：分子机制
筛选标记－插入失活
pBR322质粒载体tetr基因的插入失活效应 2
当外源DNA片断插入Tcr 基因后，导致Tcr 基因失活，变成只对 Ap有抗性，即通过对抗生素的双抗或单抗来筛选是否有外源片 断插入。
（2） 质粒克隆载体pUC18/19
• University of California的J. Messing和J. Vieria于1978年，在pBR322的基础上改造 而成。 • pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、 pUC18、pUC19 (P41)
• pUC18/19与pBR322的主要差别是用乳糖操纵子的 一个DNA片断（466bp）替换了pBR322选择标记 Tcr 基因。 • 此DNA片断含有乳糖操纵子的启动子、调节因子和β －半乳糖苷酶的α-肽基因。
pUC18/19的结构
复制起点：来自pBR322质粒。 Ampr基因：来自pBR322质粒 lacZ的启动子：来自大肠杆菌 lacZ’基因 ：大肠杆菌lacZ的肽链序列， 是LacZ 的氨基端 片断 5. 多克隆位点：10个连续的单酶 切位点，位于lacZ’基因的5’端。 1. 2. 3. 4.
组装合适的选择标记基因
• 绝大多数质粒载体都是用抗菌素抗性标记 • 不带有抗菌素抗性基因的受体菌不能在含有抗菌 素的培养基（选择培养基）中生长。 • 当带有抗菌素抗性基因的载体进入受体菌后，受 体菌才能生长。
氨苄青霉素抗性（Ampr） 卡那霉素抗性 四环素抗性 链霉素抗性 氯霉素抗性 （Kanr） （Tetr） （Strr） （Cmlr）
pBR322的结构
pBR322的构建过程
• 复制起始位点：源 于ColE1衍生质粒 pMB1。 • Apr基因：源于 pSF124质粒转座子 Tn3。 • Tcr：源于pSC101 质粒。
pBR322的优点
• 具有较小的分子量，4363bp，可以克 隆10kb以下的外源DNA。
• 含有松弛型质粒ColE1的复制起始位 点，可在E.coli HB101 和 E.coli C600等受体细胞进行高拷贝复制。 • 具有两种选择标记基因Ampr和Tetr。
• • • •
章鱼碱型 农杆碱型 农杆菌素型 琥珀碱型
Ti质粒分为4个功能区：
T－DNA区：是根癌农杆菌侵染植物细胞时从Ti 质粒上切割下来转移到植物细胞的一段DNA，含有 编码植物激素和冠瘿碱的基因 • Vir区： Vir 区上的基因能激活T-DNA转移，使根 癌农杆菌表现出毒性 • Con区：该区段上存在与细菌间接合转移的有关 基因，调控Ti 质粒在农杆菌之间的转移 • Ori区：Ori区上的基因调控Ti 质粒的自我复制。
-互补
• pUC质粒结构中的lacZ’基因所编码的-肽链 （编码β-半乳糖酶基因的氨基末端）可参与 -互补作用。这种载体适合于可编码β-半乳 糖苷酶C端部分序列的宿主细胞。虽然质粒 和宿主编码的片段各自均无活性，但它们共 处一个细胞中时可融为一体，形成具有酶学 活性的蛋白质。这样，LacZ基因上缺失近操 纵基因区段的突变株与带有完整近操纵基因 区段的β-半乳糖苷酶阴性的不同突变株之间 实现互补，这种互补现象叫做-互补。
（3） 农杆菌Ti质粒表达载体的构建 (P53)
• Ti（ tumor-inducing plasmid ）质粒：根癌农杆菌含有 一种内源质粒，当农杆菌同植物接触时，Ti质粒中有一 段DNA，称为T-DNA（transfer-DNA），能转移并整合 到植物基因组中，并导致冠瘿瘤的形成。大小因种类而异， 在200－250kb之间。
• 两种含有不同复制子结构的不同质粒，在 复制时各受自己的拷贝数控制系统的调节， 致使两种质粒的最终拷贝数恒定，因此在 经过若干复制周期和细胞分裂周期后仍能 共处于同一细胞内。 • 任何两种含有相似复制子结构的不同质粒， 不能同时存在于一个细胞中，这种现象称 为质粒的不相容性，不相容性的质粒组成 不相容性群。
选择原理
• Ampicillin 抗性和 lacZ的肽互补（蓝白 斑）相结合。 • 蓝白斑筛选
Xgal
• （5-Bromo-4-chloro-3-indolyl--Dgalactoside） • 是-半乳糖苷酶的作用底物
-半乳糖苷酶作用于Xgal显色反应
• -半乳糖苷酶能把无色的化合Xgal分解成 半乳糖和一个深蓝色的物质5-溴-4-氯靛蓝
第三章 基因克隆载体 (质粒载体)
载体 (P39)
• 概念：携带外源DNA进入宿主细胞， 并为其提供复制和功能基因表达调控系 统的工具。 • 功能 1.运送外源基因高效转入受体细胞 2.为外源基因提供复制能力或整合能力 3.为外源基因的扩增或表达提供条件
载体在基因工程中的必要性
• 目的外源DNA很难进入受体细胞 • 目的外源DNA一般不带复制子系统 • 目的外源DNA一般不具备表达的调控 系统
载体应具备的条件（P38）
• 1. 具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性
（可转移性）
• 2. 具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整 合位点 • 3. 具有多种单一的酶切位点（多克隆位点） 4. 具有合适的选择性标记
– 自我复制表达，外源基因的插入不影响其功能的发挥， 易于从宿主细胞分离出来
• 5. 分子量尽可能小，以提高其载装能力 目的基因能否有效导入受体，并在其中高效 表达，很大程度上取决于所用的载体。
插入失活
• 其中有7种限制酶：EcoRV, NheI, BamHI, SphI, SalI, XmaIII和NruI，它们的识别位点是位于四环 素抗性基因内部，另外有2种限制酶：ClaI和 HindIII的识别位点是存在于这个基因的启动区内， 在这9个限制位点上插入外源DNA都会导致tetr基 因的失活； • 还有3种限制酶(ScaI、PvuI和PstI)在氨苄青霉素 抗性基因（ampr）内具有单一的识别位点，在这 个位点插入外源DNA则会导致ampr基因的失活。 这种因DNA插入而导致基因失活的现象，称之为 插入失活效应。
pUC18/19的结构
pUC18/19质粒载体的优点
① 更小的分子量：如pUC18为2682bp，pUC8为 2750bp。
② 选择方便：Xgal显色、抗菌素双重直接选择。
③ 克隆便利：具有多克隆位点（MCS），使有两 个不同粘性末端的外源DNA方便地插入。 ④ 测序方便：pUC的MCS与M13噬菌体载体的 MCS完全相同，便于把外源DNA转移到M13载 体上测序。