中国药科大学生物制药工艺学实验设计
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实验材料:
CPU 210009菌体，1% TrioX-100，2mmol/LTris-HCl PH8.5，2mmol/L EDTA，引物E1E2， Mgcl2, dNTP,Taq DNA聚合酶
pET28a载体，Ncol, Hind I ,ddH2O,T4DNA连接酶，Taq酶，CaCl2,
溶菌酶，硫酸铵，50mmol/L,ph7.0磷酸缓冲液，ph7.6的磷酸缓冲液，50mmol/L，ph5.2的磷酸缓冲液，0.1mol/L硼酸缓冲液,奈氏试剂，蒸馏水等
5.酶活力测定：
（一）标准曲线的制作：：取6只试管按下表操作：
管号12 3 4 5 6
标准氨溶液(ml)012345
奈氏试剂(ml)2 2 22 2 2
蒸馏水(ml) 876543
静置15min
A(500nm)
（二）样品的测定：
1.精确称取样品5mg（如效价高可减少）左右置乳钵中，加5ml（先加少量）PH8.4硼酸-硼酸钠缓冲液研磨至完全溶解。再用上述缓冲液稀释至大约4000倍。
1．目的基因的制备
1.1制备模板：
用接种环挑取E.coli CPU210009菌体少许，在裂解液（1% TrioX-100，2mmol/LTris-HCl PH8.5，2mmol/L EDTA）1ml中振散，95℃加热处理10min吸取5uL作为PCR反应模板。
1.2PCR反应：
用一对与大肠杆菌门冬酰胺酶Ⅱ基因（ＡｎｓＢ）两侧序列互补的寡核苷酸Ｅ１，Ｅ２作引物，以大肠杆菌野生株ＣＰＵ２１０００９的染色体ＤＮＡ为模板，建立PCR反应体系，并进行PCR反应。
重组门冬酰胺酶II的制备,纯化和测定
（中国药科大学1044606李于采薇 1044631王沫力）
摘要：L-天冬酰胺酶（L-asparaginase,L-ASP,EC.3.5.1.1）,又名L-门冬酰胺酶或L-天门冬酰胺酶，商品名为左旋门冬酰胺酶。L-天冬酰胺酶具有显著的抗肿瘤作用，尤其是广泛应用于儿童急性淋巴细胞白血病(ALL)的治疗,其作用机制在于它能够降低人体内L-天冬酰胺和L-谷氨酰胺的浓度，专一催化L 2天冬酰胺水解成天冬氨酸和氨。大肠杆菌产生无活性的天冬酰胺酶I存在于细胞质中，而有抗癌活性的天冬酰胺酶II则分泌到细胞周质中.临床上和其它药物合用治疗淋巴母细胞瘤和恶性白血病.与普通化疗抗癌药相比,L2天冬酰胺酶既可抑制癌细胞增殖,又不伤害正常细胞,有效地实现了酶的特异抗癌作用,因而倍受关注.目前,国内临床上所用注射L2天冬酰胺酶,均从日本、美国进口.因此在获得优良菌种后,探讨提高酶产量尤为重要.
3.2将重组质粒转入感受态细胞
取1ml感受态细胞，冰上放置10到15分钟，加入待转化的质粒（每200ul感受态细胞加入质粒体积不超过10ul），轻轻放置45分钟。随后，在42℃水浴中热击90秒，热击后迅速置于冰上冷却5分钟。加入1mlLB液体培养基，混匀后37℃震荡培养1小时后，5000转10分钟离心。将菌液弃去500ul上清，剩余500ul摇匀后，涂布于含氨苄西林的固体LB平板上，要不停涂抹直至菌液完全被吸干，后盖上盖子，培养基面向上，37℃培养12-18小时。通过平板的抗性筛选，得到具有抗性的重组质粒转化的E.coli CPU210009单菌落。
2.2酶切体系：
PCR产物10ulpET28a37ul
10×Tango 3ul 10× Tango 5ul
NcoI1.5ulNcoI 4ulHindI1.5ul HindI 4ul
ddH2O 18ul
注意：ddH2OБайду номын сангаас于补足反应体系，加入量应根据加入的模板DNA的量进行调节
混匀后，瞬时离心，置于37°C中酶切3h。酶切结束后，迅速将反应产物在45°C水浴中放置5min,再于冰上放置2min冷却，可防止自连。对酶切后的PCR产物和pET28a再次进行纯化，并与第一次纯化前的样品，以及酶切后未纯化的样品一起上核酸电泳检测。
3.4发酵培养：
配制培养基：
牛肉膏5g
蛋白胨10g
NaCl5g
琼脂15-20g
水1000ml
PH7.41
高压蒸汽灭菌20分钟
筛选后呈阳性的重组工程菌于斜面培养基上培养24h,温度保持37℃。
菌种经过斜面培养后，接种到液体培养基中，于37℃、250r/min下摇瓶培养16h。
4.重组酶的分离纯化：
4．1蔗糖溶液抽提
TaqDNA聚合酶0.7ul
PCR反应条件：(循环28次)
94°C1min；60°C2min；72°C1min
注意：
1.PCR产物通过核酸电泳进行初步分子量的观测。
2.然后送样测序，与NCBI中基因序列对比后，得到准确的目的基因片段。
2．重组质粒的构建
2.1载体的制备
购得含pET28a的菌种，LB培养基37°C，200rpm过夜培养后，使用质粒小提试剂盒提取pET28a,并通过核酸电泳检测其分子量。
2.取0.04mol/L的L-门冬酰胺1ml，0.1mol/L PH8.4硼酸-硼酸钠缓冲液1ml，酶液0.2ml于试管中，于37℃水浴保温10min，加15%三氯乙酸0.5ml终止反应，经4000r/min离心15min，取上清液1ml，加奈氏试剂2ml和蒸馏水7ml，放置15min后于500nm波长比色测定生成的氨。在上述条件下，每分钟催化L-门冬酰胺水解释放1µmol氨的酶量定义为1个酶活力单位。
3.3阳性重组子的筛选
将涂布在含有氨苄青霉素的LB平板上长出的单菌落用牙签逐个挑入方格化的新鲜LB培养基上，为每个克隆编号。平板37°C温箱中过夜，待菌落形成后用灭菌牙签逐个挑选少量菌体，移入预先加有0.1mmol/L硼酸缓冲液（ph 8.4）50ul的酶标板反应孔里，待菌体分散后每孔加入0.04mmol/L天门冬酰胺底物溶液50ul，37°C保温15min，加入奈氏试剂50ul，呈深红棕色孔内相应的单菌落即为阳性转化子。
2.3连接
PCR产物14ul
pET28a3ul
10×ligse buffer2ul
T4连接酶1ul
将上述混匀后，封口，放置过夜。
3.转化
3.1感受态细胞的制备
取保种的E.coli CPU210009菌体至少500ul,接种于10ml LB液体培养基中,37℃下振荡培养12小时至14小时,直至对数生长后期(相当浑浊)取该菌液100ul接种于液体培养基中,37℃振荡培养1.5小时至OD600=0.4左右，将菌液分装于1.5ml EP管中,冰上放置15分钟,后迅速于4℃下5000g离心10分钟,弃去上清,用预冷的的0.1MCaCl2溶液400ul轻轻悬浮细胞,冰上放置30分钟后,4℃下5000g离心10分钟,弃去上清，加入预冷的含0.1M的CaCl2溶液80ul轻轻悬浮细胞，冰上放置5分钟，即成感受态细胞悬液。
酶活力（µ/ml）=【样品的氨浓度（mol/ml）- 对照的氨浓度（mol/ml）】/（3*10^3）
参考文献
[1]吴晓英，吴振强，林影，夏枫耿.L-天冬酞胺酶的研究进展[J] 广东药学2003年第13卷第6期
[2] 刘景晶,金健勤,戴海滨,吴梧桐. 大肠杆菌L-天门冬酸胺酶的提取和纯化[J] 药物生物技术1995，2(l)
4.3DEAE-纤维素柱层析分离
DEAE-纤维素DE52柱4.5×30 cm,经5 mmol/L PBS( pH6.4)平衡后上样,用相同缓冲液洗涤至基线平稳,改用50 mmol/L PBS( pH6.4)洗脱,收集显示酶活性组分,冷冻干燥后即得高纯度的L-门冬酰胺酶Ⅱ冻干粉。
离子交换分离条件：在用DEAE-纤维素DE52层析时,大部分杂质不被交换吸附。只要用5 mmol/ L PBS洗脱,就可除去大部分杂质,被吸附住的杂质用50 mmol/ L PBS难以洗脱,故可得到高纯度的产品。
将菌体悬浮于破壁液( 45%蔗糖, 10 mmol/ LEDTA, 200 mg/ L溶菌酶)中,在30℃搅拌70 min后搅拌下倾入大量水中,加入MnCl2沉淀菌体碎片和核酸,离心,取上清液即得酶提取液。
4.2硫酸铵分级沉淀和乙醇分级沉淀
酶提取液中加入硫酸铵至55%饱和度,离心除去沉淀,上清液中加入硫酸铵至90%饱和度,离心收集沉淀,沉淀物使溶解并透析脱盐。脱盐酶液中加入乙醇至33%(v/v) ,离心除去沉淀的杂蛋白,上清液部分加乙醇至40%(v/v) ,得沉淀A。沉淀A部分用50 mmol/L PBS( pH6. 4)悬浮,离心后于上清液中加乙醇至45%(v/v) ,得沉淀B,沉淀B用5 mmol/LPBS( pH6.4)溶解即得纯度较高的酶。
[3] 蔡丽萍,杨冠东,卢勇涛,杜少平. L-天门冬酰胺酶的提取和纯化工艺改进[J] 广东药学2002年12卷第5期
[4] 王弘,吴梧桐,刘景晶,顾学裘 重组L-天冬酰胺酶制剂稳定性研究[J] 药物生物技术
[5]乐薇,孙小梅,李步海,大肠杆菌的培养及L2天冬酰胺酶活力的测定,中南民族大学学报2003年9月
管号123
0.04mol/LL-门冬酰胺（ml）111
PH8.4硼酸-硼酸钠缓冲液（ml）111.2
待测酶液 0.20.20
37℃水浴保温10min
15%三氯乙酸（ml）0.50.50.5
4000r/min离心15min，分别取上清1ml
分别加奈氏试剂2ml和蒸馏水7ml放置15min
A(500nm)
Ｅ１：5’- GGCCATGGAGTTTTTCAAAAAGACGGCACTTGC - 3’
Ｅ2:5’- GGAAGCTTAGACTGATTGAAGATCTGCTGG–3’
模板13.5ul
引物I0.5ul
引物II0.5ul
10×buffer2.5ul
25mMMgcl2 1.2ul
2.5nM dNTP1.6ul
CPU 210009菌体，1% TrioX-100，2mmol/LTris-HCl PH8.5，2mmol/L EDTA，引物E1E2， Mgcl2, dNTP,Taq DNA聚合酶
pET28a载体，Ncol, Hind I ,ddH2O,T4DNA连接酶，Taq酶，CaCl2,
溶菌酶，硫酸铵，50mmol/L,ph7.0磷酸缓冲液，ph7.6的磷酸缓冲液，50mmol/L，ph5.2的磷酸缓冲液，0.1mol/L硼酸缓冲液,奈氏试剂，蒸馏水等
5.酶活力测定：
（一）标准曲线的制作：：取6只试管按下表操作：
管号12 3 4 5 6
标准氨溶液(ml)012345
奈氏试剂(ml)2 2 22 2 2
蒸馏水(ml) 876543
静置15min
A(500nm)
（二）样品的测定：
1.精确称取样品5mg（如效价高可减少）左右置乳钵中，加5ml（先加少量）PH8.4硼酸-硼酸钠缓冲液研磨至完全溶解。再用上述缓冲液稀释至大约4000倍。
1．目的基因的制备
1.1制备模板：
用接种环挑取E.coli CPU210009菌体少许，在裂解液（1% TrioX-100，2mmol/LTris-HCl PH8.5，2mmol/L EDTA）1ml中振散，95℃加热处理10min吸取5uL作为PCR反应模板。
1.2PCR反应：
用一对与大肠杆菌门冬酰胺酶Ⅱ基因（ＡｎｓＢ）两侧序列互补的寡核苷酸Ｅ１，Ｅ２作引物，以大肠杆菌野生株ＣＰＵ２１０００９的染色体ＤＮＡ为模板，建立PCR反应体系，并进行PCR反应。
重组门冬酰胺酶II的制备,纯化和测定
（中国药科大学1044606李于采薇 1044631王沫力）
摘要：L-天冬酰胺酶（L-asparaginase,L-ASP,EC.3.5.1.1）,又名L-门冬酰胺酶或L-天门冬酰胺酶，商品名为左旋门冬酰胺酶。L-天冬酰胺酶具有显著的抗肿瘤作用，尤其是广泛应用于儿童急性淋巴细胞白血病(ALL)的治疗,其作用机制在于它能够降低人体内L-天冬酰胺和L-谷氨酰胺的浓度，专一催化L 2天冬酰胺水解成天冬氨酸和氨。大肠杆菌产生无活性的天冬酰胺酶I存在于细胞质中，而有抗癌活性的天冬酰胺酶II则分泌到细胞周质中.临床上和其它药物合用治疗淋巴母细胞瘤和恶性白血病.与普通化疗抗癌药相比,L2天冬酰胺酶既可抑制癌细胞增殖,又不伤害正常细胞,有效地实现了酶的特异抗癌作用,因而倍受关注.目前,国内临床上所用注射L2天冬酰胺酶,均从日本、美国进口.因此在获得优良菌种后,探讨提高酶产量尤为重要.
3.2将重组质粒转入感受态细胞
取1ml感受态细胞，冰上放置10到15分钟，加入待转化的质粒（每200ul感受态细胞加入质粒体积不超过10ul），轻轻放置45分钟。随后，在42℃水浴中热击90秒，热击后迅速置于冰上冷却5分钟。加入1mlLB液体培养基，混匀后37℃震荡培养1小时后，5000转10分钟离心。将菌液弃去500ul上清，剩余500ul摇匀后，涂布于含氨苄西林的固体LB平板上，要不停涂抹直至菌液完全被吸干，后盖上盖子，培养基面向上，37℃培养12-18小时。通过平板的抗性筛选，得到具有抗性的重组质粒转化的E.coli CPU210009单菌落。
2.2酶切体系：
PCR产物10ulpET28a37ul
10×Tango 3ul 10× Tango 5ul
NcoI1.5ulNcoI 4ulHindI1.5ul HindI 4ul
ddH2O 18ul
注意：ddH2OБайду номын сангаас于补足反应体系，加入量应根据加入的模板DNA的量进行调节
混匀后，瞬时离心，置于37°C中酶切3h。酶切结束后，迅速将反应产物在45°C水浴中放置5min,再于冰上放置2min冷却，可防止自连。对酶切后的PCR产物和pET28a再次进行纯化，并与第一次纯化前的样品，以及酶切后未纯化的样品一起上核酸电泳检测。
3.4发酵培养：
配制培养基：
牛肉膏5g
蛋白胨10g
NaCl5g
琼脂15-20g
水1000ml
PH7.41
高压蒸汽灭菌20分钟
筛选后呈阳性的重组工程菌于斜面培养基上培养24h,温度保持37℃。
菌种经过斜面培养后，接种到液体培养基中，于37℃、250r/min下摇瓶培养16h。
4.重组酶的分离纯化：
4．1蔗糖溶液抽提
TaqDNA聚合酶0.7ul
PCR反应条件：(循环28次)
94°C1min；60°C2min；72°C1min
注意：
1.PCR产物通过核酸电泳进行初步分子量的观测。
2.然后送样测序，与NCBI中基因序列对比后，得到准确的目的基因片段。
2．重组质粒的构建
2.1载体的制备
购得含pET28a的菌种，LB培养基37°C，200rpm过夜培养后，使用质粒小提试剂盒提取pET28a,并通过核酸电泳检测其分子量。
2.取0.04mol/L的L-门冬酰胺1ml，0.1mol/L PH8.4硼酸-硼酸钠缓冲液1ml，酶液0.2ml于试管中，于37℃水浴保温10min，加15%三氯乙酸0.5ml终止反应，经4000r/min离心15min，取上清液1ml，加奈氏试剂2ml和蒸馏水7ml，放置15min后于500nm波长比色测定生成的氨。在上述条件下，每分钟催化L-门冬酰胺水解释放1µmol氨的酶量定义为1个酶活力单位。
3.3阳性重组子的筛选
将涂布在含有氨苄青霉素的LB平板上长出的单菌落用牙签逐个挑入方格化的新鲜LB培养基上，为每个克隆编号。平板37°C温箱中过夜，待菌落形成后用灭菌牙签逐个挑选少量菌体，移入预先加有0.1mmol/L硼酸缓冲液（ph 8.4）50ul的酶标板反应孔里，待菌体分散后每孔加入0.04mmol/L天门冬酰胺底物溶液50ul，37°C保温15min，加入奈氏试剂50ul，呈深红棕色孔内相应的单菌落即为阳性转化子。
2.3连接
PCR产物14ul
pET28a3ul
10×ligse buffer2ul
T4连接酶1ul
将上述混匀后，封口，放置过夜。
3.转化
3.1感受态细胞的制备
取保种的E.coli CPU210009菌体至少500ul,接种于10ml LB液体培养基中,37℃下振荡培养12小时至14小时,直至对数生长后期(相当浑浊)取该菌液100ul接种于液体培养基中,37℃振荡培养1.5小时至OD600=0.4左右，将菌液分装于1.5ml EP管中,冰上放置15分钟,后迅速于4℃下5000g离心10分钟,弃去上清,用预冷的的0.1MCaCl2溶液400ul轻轻悬浮细胞,冰上放置30分钟后,4℃下5000g离心10分钟,弃去上清，加入预冷的含0.1M的CaCl2溶液80ul轻轻悬浮细胞，冰上放置5分钟，即成感受态细胞悬液。
酶活力（µ/ml）=【样品的氨浓度（mol/ml）- 对照的氨浓度（mol/ml）】/（3*10^3）
参考文献
[1]吴晓英，吴振强，林影，夏枫耿.L-天冬酞胺酶的研究进展[J] 广东药学2003年第13卷第6期
[2] 刘景晶,金健勤,戴海滨,吴梧桐. 大肠杆菌L-天门冬酸胺酶的提取和纯化[J] 药物生物技术1995，2(l)
4.3DEAE-纤维素柱层析分离
DEAE-纤维素DE52柱4.5×30 cm,经5 mmol/L PBS( pH6.4)平衡后上样,用相同缓冲液洗涤至基线平稳,改用50 mmol/L PBS( pH6.4)洗脱,收集显示酶活性组分,冷冻干燥后即得高纯度的L-门冬酰胺酶Ⅱ冻干粉。
离子交换分离条件：在用DEAE-纤维素DE52层析时,大部分杂质不被交换吸附。只要用5 mmol/ L PBS洗脱,就可除去大部分杂质,被吸附住的杂质用50 mmol/ L PBS难以洗脱,故可得到高纯度的产品。
将菌体悬浮于破壁液( 45%蔗糖, 10 mmol/ LEDTA, 200 mg/ L溶菌酶)中,在30℃搅拌70 min后搅拌下倾入大量水中,加入MnCl2沉淀菌体碎片和核酸,离心,取上清液即得酶提取液。
4.2硫酸铵分级沉淀和乙醇分级沉淀
酶提取液中加入硫酸铵至55%饱和度,离心除去沉淀,上清液中加入硫酸铵至90%饱和度,离心收集沉淀,沉淀物使溶解并透析脱盐。脱盐酶液中加入乙醇至33%(v/v) ,离心除去沉淀的杂蛋白,上清液部分加乙醇至40%(v/v) ,得沉淀A。沉淀A部分用50 mmol/L PBS( pH6. 4)悬浮,离心后于上清液中加乙醇至45%(v/v) ,得沉淀B,沉淀B用5 mmol/LPBS( pH6.4)溶解即得纯度较高的酶。
[3] 蔡丽萍,杨冠东,卢勇涛,杜少平. L-天门冬酰胺酶的提取和纯化工艺改进[J] 广东药学2002年12卷第5期
[4] 王弘,吴梧桐,刘景晶,顾学裘 重组L-天冬酰胺酶制剂稳定性研究[J] 药物生物技术
[5]乐薇,孙小梅,李步海,大肠杆菌的培养及L2天冬酰胺酶活力的测定,中南民族大学学报2003年9月
管号123
0.04mol/LL-门冬酰胺（ml）111
PH8.4硼酸-硼酸钠缓冲液（ml）111.2
待测酶液 0.20.20
37℃水浴保温10min
15%三氯乙酸（ml）0.50.50.5
4000r/min离心15min，分别取上清1ml
分别加奈氏试剂2ml和蒸馏水7ml放置15min
A(500nm)
Ｅ１：5’- GGCCATGGAGTTTTTCAAAAAGACGGCACTTGC - 3’
Ｅ2:5’- GGAAGCTTAGACTGATTGAAGATCTGCTGG–3’
模板13.5ul
引物I0.5ul
引物II0.5ul
10×buffer2.5ul
25mMMgcl2 1.2ul
2.5nM dNTP1.6ul