新环肽的研究

摘要：从非核糖体肽合成酶的C末端硫酯酶（TE）的结构域（NRPSs ）催化在多样的生物活性分子的生物合成的最后一步。在许多系统中，硫酯酶结构域参与呈现为线性前体的大环酰基-S-酶中间体。从tyrocidine切除的硫酯酶域NRPS已经显示出催化的肽的硫酯基，模仿自然酰基-S-的酶底物的环化反应。在这项工作中，我们探讨环由孤立的TE催化结构域的通用性。使用合成肽的硫酯基的6至14个残基的长度，我们表明，从短杆菌酪肽NRPS切除TE域可用于生成环肽具有可比动力学效率的大小的阵列。我们还研究了从该生物合成的对称环十肽短杆菌肽S与环状lipoheptapeptide枯草A.两个TE结构域表现出预期的环化活性的NRPSs的切下的TE域：从短杆菌肽šNRPS的TE域催化的头- 尾环化十肽硫酯，以形成短杆菌肽S，并且从枯草NRPS的TE域催化立体特异性环化以形成枯草的大环内酯类似物。并着眼于由TE催化产生环状分子的文库，我们报告的固相合成和的线性肽硫酯池小TE-介导的环化反应。这些研究提供的证据是TE催化的合成一系列大环化合物的一种手段一般效用。正文：非核糖体肽合成酶（NRPSs ），1个聚酮合成酶（PKSs ）和混合NRPS / PKS系统产生的生物活性分子的一个令人难以置信的多样化（图1）（1,2）。许多这些分子具有大环结构，包括免疫抑制剂环孢菌素，抗生素红霉素和达托霉素，和抗癌剂的埃坡霉素。相比其线性类似物的大环结构减小分子的构象灵活性，这可以将其限制为具有生物活性的构象。非核糖体肽合成酶的模块化组织促进不同结构的合成。每个NRPS模块包含几个半自治的酶域（图2A）（1-4）。一种腺苷酸（A ）结构域激活一个特定的氨基酸为氨腺苷酸，这后来成为共价键被拴硫酯连接到一个包含phosphopantethiene肽载体蛋白（PCP）。在这个阶段中，栓系氨基酸可以通过额外的域，包括差向异构化，N -甲基化，并heterocyclization 域被修改。链伸长率通过缩合（C）结构域的夫妇从上游PCP域到下游氨酰-S- PCP ，最终在完成线性肽的产生生长链前体系在最C端的PCP域（肽催化- S -PCP ）。

最终产物的释放通常是由一个C -末端硫酯酶（TE）域，其催化的最C端的PCP （图2B）的脱酰化催化。TE催化的机理涉及到从终端的PCP域转移的线性肽以在TE域的活性位点丝氨酸残基而形成的肽-O -TE的中间体（5 ，6）。中间体的脱酰涉及任水解释放的直链肽，或在环状产物，分子内的亲核试剂的反应的情况下。用于环化的TE域，TE提供多样性和复杂性的来源为各种基团可以在环化反应，包括N末端氨基基团的亲核试剂（导致头- 尾环化反应），如肽抗生素tyrocidine A（7）和短杆菌肽S（8），其侧链的亲核试剂（从而产生支链环状分子），为在抗生素杆菌肽A（9）和达托霉素（10），和THEA -羟基AA-羟基脂肪酸如枯草A（11）（图1）。

图1：通过NRPS ，PKS ，以及混合NRPS / PKS系统产生的大环结构，例如可以按照类型组织由TE的催化环化反应形成联动：头- 尾环化反应，低聚反应/环化，或支链的环化反应。该生物合成过程中由TE催化形成的图是由阴影标出。

图2 ：（一）tyrocidine示意图，短杆菌肽S和枯草非核糖体肽合成酶。方块代表个人蛋白质结构域：一，腺苷酸化;五氯酚，肽载体蛋白; E，差向异构化; C，冷凝，TE ，硫酯酶（阴影部分）。上海代表phosphopantetheine和OH的TE活性位点丝氨酸。在本文中，TE从每个合成是通过克隆切除的研究，表达，和分离的结构域的纯化。硫酯酶催化结构域（二）机构：肽-O -TE酰基- 酶中间是通过来自终端的肽基载体蛋白（PCP）的phosphopantethiene转让的肽链的活性位点丝氨酸形成在TE域。用于水解的TE域，中间被水捕获，生成直链肽;对于TE的环化域的分子内的亲核试剂捕获中间，产生了环状产物。最近，我们从硫酯酶催化环化的通用性克隆的TE域（TycC TE ）。

图3：肽环化由（A ）催化切除的硫酯酶域硫酯基的tyrocidine NRPS ，（二）短杆菌肽NRPS ，和（C ）的枯草NRPS 。的肽的硫酯基模拟肽-S- PCP，天然底物的TE域。

该tyrocidine NRPS亚基TycC （724 kDa）的，并表示它是一个孤立的28 kDa的结构域（12）。

合成肽Nacetylcysteamine硫酯（肽SNAC ）作为模拟连接到最C端的PCP （多肽- PCP）的phosphopantethiene全长线性肽。肽SNAC的分离TycC TE高效催化headto - 尾环化反应以形成环状抗生素tyrocidine A（图3A）。不同衬底残基，发现该TE是在其环化底物类似物的能力相当宽松。只有两个残基中，一个十肽底物的每个端部附近，被证明是所需的有效的环化：在N末端的D-苯丙氨酸所提供的绝对立体化学和侧链的要求进行环化，变更ORN相邻的C-末端残基成Glu急剧降低的环化率（12）。进一步探讨了用于环化的肽主链的要求表明，靠近环化结一些主链的酰胺键所需要的有效的环化（13）。已经从这些研究中出现的模型表明，它满足这些最低要求各种基材由TE催化环化（13 ）。

并着眼于探讨孤立的TE域的一般合成程序，我们着手研究了三种不同的TE域，从tyrocidine切除，短杆菌肽S，和枯草合成酶。在确定了TycC TE能够催化十肽硫酯基的环化反应，在这里我们探讨其催化环化，以形成环肽从6至14个残基不等的大小的能力。此外，我们克隆，表达和纯化的短杆菌肽ŠNRPS （GrsB TE ）孤立的TE域，并从枯草NRPS （SRFA -C TE），并评估自己的能力，催化环化，形成短杆菌肽S和的枯草A中的脂肽类似物分别（见图3）。最后，我们报告的肽的硫酯的池小的固相合成和测试TycC的TE中，以将其转换为相应的环肽的池的功能。这些研究提供了证据，该方法对大环化合物的合成的一般效用。

EXPERIMENTAL PROCEDURES实验步骤

克隆和TycC TE ，GrsB TE和SRFA -C TE域的表达。TycC TE被克隆，表达和纯化，如先前所述（12）。对于GrsB TE和SRFA -C TE ，基因片段通过PCR方法从染色体DNA上使用排气聚合酶（New England Biolabs公司）进行扩增。

GrsB TE （含有GrsB残基4163-4452 ）中的扩增使用寡核苷酸5'- TTT CCA TGG TTA CAC ATA AAG AAT CAG AA -3'和5'- ATA GGA TCC TTT

TAC TAC AAA TGT CCC TTG -3'从染色体DNA ofBacillus短ATCC 9999 ，消化withNcoI和BamHI （Amersham）上，并连接intoNcoI / BglII位消化pQE60 （Qiagen公司），该追加的C-末端His6标签的表达的蛋白质。使用寡核苷酸5'- ATA AGA TCT AAC GGG GGC TCT GAT GG -3'和5'- TGA TAT GGA TCC AAC CGT TAC GGT TTG的SRFA -C TE的编码序列（含SRFA -C的残基1041至1274年），扩增TG -3' ，从芽孢杆菌属subtilisJH642的染色体DNA ，消化withBamHI andBglII ，并连接到pQE60预先用BglII消化，并用CIP （New England Biolabs公司）脱磷酸化，得到的载体pQE60 -TE （SRFA -C）。标准方法用于所有的DNA操作（14）。克隆产物经测序与ABI PRISM 310遗传分析仪证实。对于表达，所述重组质粒转化到大肠杆菌coliM15 / pREP4的盒（Qiagen ）。细胞生长至OD）0.5（600纳米），诱导用0.2mM的IPTG ，然后在24℃下为pQE60 -TE （GrsB ），并在30 ℃下的pQE -TE （SRFA -C）6小时生长。所表达的蛋白进行的Ni-NTA affininty色谱法（图4）进行纯化并透析至25mM的HEPES，50mM的NaCl和10％甘油，pH为7.0 。

标准肽SNAC Synthesis.Peptide硫代酯基，但不包括肽硫酯LIB1 （下面详述）的文库，合成了一个两步过程涉及固相肽合成之后solutionphase硫代酯的形成。肽合成上进行使用二异丙基（DIPCDI ）一种PerSeptive公司Biosystems公司9050合成仪（0.3毫摩尔规模）/羟基苯并三唑（HOBt）化学和2 - 氯三苯甲基树脂衍生的L-列伊。联轴器进行用Fmoc -保护的氨基酸（Novabiochem ），除了对N- terminalD -苯丙氨酸GLPsubstrates的，这是Boc保护。侧链保护基团用BOC为ORN和Trp ，叔丁基对酪氨酸，苏氨酸，天门冬氨酸和谷氨酸，以及三苯为天冬酰胺和谷氨酰胺。在substratesSLP - 1RandSLP -1S的合成的最终偶联，分别，R-和S-3 -羟基丁酸被用于（Aldrich公司）。1：1：3的混合物的乙酸/三氟乙醇/二氯甲烷来切割从树脂（3小时，24℃）的肽。然后将树脂过滤除去，将肽沉淀withn - 己烷，使溶剂通过旋转蒸发除去。被保护的肽溶解在THF中，并通过加入DCC （1.2当量），然后添