转基因技术与作物育种

（二）目的基因重组质粒的构建
（三）受体材料的选择
受体材料的条件：

高效稳定的再生能力； 较高的遗传稳定性；


有稳定的外植体来源；
对筛选剂敏感。
受体材料的类型：

愈伤组织再生系统；
直接分化再生系统； 原生质体再生系统； 胚状体再生系统； 生殖细胞再生系统。
（四）转基因方法的确定和外源基因的转化
一、转基因技术的发展现状

（一）国际转基因植物研究与现状
全世界转基因的种植面积：1996年的280万公顷， 2001年增加到5260万公顷，至2005年，种植面积增 至9000万公顷； 种植转基因的主要国家：美国、阿根廷、加拿大、 中国等； 种植主要转基因作物：大豆、玉米、棉花和油菜； 转基因作物的主要目标：抗除草剂、抗病虫性；
PCR直接扩增克隆目的基因

PCR直接扩增克隆是一种参考已知基因序列 克隆基因的方法。

目前已知很多植物基因的序列，当克隆类似
基因时，可先从Genebank库中找到有关基因 序列，用PCR方法克隆不同植物的基因。


方 法： 根据已知基因的序列，设计并合成一对引物； 从植物中提取DNA进行PCR扩增； 扩增片段的纯化； 酶切纯化的扩增片段及载体，回收酶切片断； 将两片段用连接酶连接； 重组体转化大肠杆菌； 用酶切分析和序列分析检测重组子，并与已知 基因序列进行比较；
1、转目的基因植物的标准： 有严格的对照； 有转化当代目的基因整合和表达的分子生物 学证据； 转化当代需有目的基因控制的表型性状； 有性繁殖作物需有目的基因控制的表型性状 传递给后代的证据。
2、转化体的筛选 抗生素抗性基因：如卡那霉素抗性基因NPTII 除草剂抗性基因：如抗除草剂的bar基因。 3、转化体的鉴定 DNA水平的鉴定：southern杂交； 转录水平的鉴定：northern杂交； 翻译水平的鉴定：western杂交。
Bt基因及其应用


苏云金杆菌产生的具有高度特异性杀虫活性的 蛋白。又称内毒素或杀虫结晶蛋白（IPC). 作用原理： IPC通常以原毒素形式存在，当昆虫取食IPC后， 在昆虫的消化道内，原毒素被活化，活化的 IPC能与昆虫肠道上皮细胞上面的特异性蛋白 结合。结合以后的IPC全部或部分嵌合于细胞 膜中，使细胞膜产生一些孔道，从而导致细胞 由于渗透平衡被破坏而破裂。昆虫幼虫将停止 进食，最终死亡。
基因工程的别名 操作环境 操作对象 操作水平
基因拼接技术或DNA重组技术 生物体外 基 因
DNA分子水平
基本过程
结果
剪切→拼接→导入→表达
人类需要的基因产物
转基因育种的优势

基因资源大大拓宽； 提供了新的育种途径； 可以对目标性状进行定向变异和定向选择； 提高了选择效率，加快育种进程。
蛋白酶抑制剂基因及其应用

蛋白酶抑制剂是一类蛋白质，在大多数植物种 子和块茎中，其含量可高达总蛋白的1－10％。

抗虫原理：
蛋白酶抑制剂与昆虫消化道内蛋白消化酶相 结合，阻断或减弱蛋白酶对外源蛋白质的水解 作用，导致蛋白质不能被正常消化；使昆虫不 能正常发育。
几丁质酶和β－1，3葡聚糖酶基因
1）修饰除草剂作用的靶蛋白，使其对除草 剂不敏感或促其过量表达以使植物吸收除草 剂后仍能进行正常代谢；
2）引入酶或酶系统，在除草剂发生作用前 将其降解或解毒。 转基因大豆
面包烘烤质量的种子贮藏蛋白改良

通过增加HMW谷蛋白亚基的拷贝数来增加HMW的 含量，从而改善加工品质； 引入与面包烘烤品质密切相关的HMW谷蛋白亚 基，改变亚基类型，通过改善亚基质量来改善 加工品质
第十三章 转基因技术 与作物育种
第十三章
转基因技术与作物育种
转基因育种：根据育种目标，从供体生物中 分离目的基因，经DNA重组与遗传转化或直 接运载进入受体作物，经过筛选获得稳定表 达的遗传工程体，并经过田间试验与大田选 择育成转基因新品种或种质资源。

基因工程原理：应用人工方法把生物的遗传物 质（主要是DNA），在体外进行切割、拼接和重 组，然后将重组了的DNA导入某种宿主细胞或个 体中，从而改变它们的遗传特性；有时还使新 的遗传物质在新的宿主细胞或个体中大量表达， 以得到基因产物。

作用Hale Waihona Puke Baidu理：
几丁质酶存在于植物和微生物中，具有降 解几丁质的作用。病原真菌细胞壁中几丁质 的降解，破坏细胞新物质的沉积，致使病原 体死亡。几丁质酶活性的增强也往往伴随着 β－1，3－葡聚糖酶及其他抗病PR蛋白的形成， 共同发挥植物的防卫作用。
耐除草剂基因及其应用

耐除草剂基因工程主要有两种策略：

高压电穿孔法；
3、种质系统介导基因转化
特点： 转化过程不是依靠物理化学过程，而是依靠 生物自身的种质系统来实现的； 不需要植物组织、细胞等离体培养过程； 植物整体水平上的转化； 方法简便易行； 主要方法包括： 花粉管通道法； 子房、幼胚注射法；
（五）转化体的筛选和鉴定
1、载体介导遗传转化系统

叶盘法：用打孔器打出叶园盘，将带有新鲜伤 口的叶园盘与载有目的基因的农杆菌进行短期 共培养，农杆菌通过伤口感染将外源目的基因 导入细胞内并整合到植物的基因组中。
真空渗入法：

2、外源基因直接导入法

基因枪轰击法：将外源DNA包裹在金粉颗粒表 面，借助高压动力射入受体细胞和组织，当 微粒上的DNA进入细胞后将整合到植物基因组 中并得以表达。 化学刺激法；

（二）目的基因的获得

根据基因表达产物－蛋白质进行基因克隆；
1）分离纯化蛋白质；
2）氨基酸序列测定；
3）推导核苷酸序列； 4）化学合成该基因； 5）基因的功能鉴定。

从基因组DNA或mRNA序列克隆基因
1、PCR技术在植物基因克隆中的应用
2、基因文库技术分离目的基因
3、mRNA差别显示技术分离差别表达基因
我国转基因作物： 转Bt基因的抗虫棉、延迟成熟的转基因番 茄、抗病毒病的转基因甜椒等。 如我国转基因抗虫棉种植面积达4000多万 亩，而国产转基因抗虫棉种植面积达到70% 左右，其中河北、山东、河南、安徽4省实 现了100%的种植。

二、转基因育种的程序
（一）农业中主要的目的基因 抗植物虫害基因及其利用 抗植物病害基因及其利用 抗非生物胁迫基因及其利用 改善作物品质的基因及其利用 改良作物产量的基因及其利用