番茄灰霉病拮抗芽孢杆菌LW-6-1的筛选、鉴定及抑菌活性研究

番茄灰霉病拮抗芽孢杆菌LW-6-1的筛选、鉴定及抑菌活性

研究

刘伟;宋双;沈小英;安天赐;牛小义;安德荣

【摘要】[目的]从福建、四川、陕西等地耕作土壤中筛选对番茄灰霉病有较强生防效果的拮抗芽孢杆菌.[方法]随机采集福建、四川、陕西等地耕作土壤样品30份,采用平板稀释法从中分离芽孢杆菌,以番茄灰霉病菌、稻瘟病菌、辣椒疫霉病菌、苹果轮纹病菌、小麦根腐病菌、棉花枯萎病菌为靶标菌筛选拮抗芽孢杆菌;检测拮抗芽孢杆菌菌株无菌发酵液对供试病原真菌菌丝生长、孢子萌发、菌丝形态的影响;通过形态学特征、生理生化特征及16S rDNA序列分析,对筛选出的拮抗菌株进行鉴定.[结果]从采集的30份土壤样品中分离得到273株芽孢杆菌,经病原真菌定向筛选后,得到1株对番茄灰霉病菌、稻瘟病菌、辣椒疫霉病菌、苹果轮纹病菌、小麦根腐病菌、棉花枯萎病菌有较强生防效果的芽孢杆菌LW-6-1,LW-6-1菌株无菌发酵液对番茄灰霉病菌和稻瘟病菌菌丝生长的抑制效果较好,菌丝生长抑制率分别为95.34％和92.56％,EC50分别为10.18和10.84 mL/L;对抑制番茄灰霉病菌和稻瘟病菌孢子萌发的抑制率分别为93.98％和92.09％,EC50分别为2.03和2.67 mL/L.经鉴定,LW-6-1为甲基营养型芽孢杆菌Bacillusmeth ylotrophicus.[结论]筛选到的拮抗芽孢杆菌LW-6-1对番茄灰霉病有较强的生防效果,能显著抑制番茄灰霉病菌的生长.

【期刊名称】《西北农林科技大学学报（自然科学版）》

【年(卷),期】2013(041)011

【总页数】7页(P73-79)

【关键词】番茄灰霉病;拮抗芽孢杆菌;生物防治;甲基营养型芽孢杆菌

【作者】刘伟;宋双;沈小英;安天赐;牛小义;安德荣

【作者单位】西北农林科技大学植物保护学院/旱区作物逆境生物学国家重点实验室,陕西杨凌712100;西北农林科技大学植物保护学院/旱区作物逆境生物学国家重点实验室,陕西杨凌712100;西北农林科技大学植物保护学院/旱区作物逆境生物学国家重点实验室,陕西杨凌712100;西北农林科技大学植物保护学院/旱区作物逆境生物学国家重点实验室,陕西杨凌712100;西北农林科技大学植物保护学院/旱区作物逆境生物学国家重点实验室,陕西杨凌712100;西北农林科技大学植物保护学院/旱区作物逆境生物学国家重点实验室,陕西杨凌712100

【正文语种】中文

【中图分类】S476.19;S154.39

番茄灰霉病由灰葡萄孢(Botrytis cinerea Persex Fr．)侵染所致，是一种世界性重要病害。该病菌主要危害叶片及果实，对保护地番茄生产构成极大威胁，已成为番茄设施栽培的限制性障碍。由于抗病育种难以进行，国内目前对于该病的防治主要依靠化学防治，但化学药剂的大量应用常常导致农药残留。应用有益微生物防治番茄灰霉病对人畜安全无毒，既不污染环境，也无残留危害，且有利于保持生态平衡，因此其更有利于维持农业的可持续发展[1]。许多生物与灰葡萄孢菌具有拮抗作用，因此利用生物拮抗菌可以控制番茄灰霉病。研究表明，木霉、浅白隐球酵母、黏帚霉、多种细菌及放线菌等对灰葡萄孢菌有抑制作用[2-7]。有研究表明，在设施栽

培条件下，喷洒枯草杆菌Quadral36(Bacillus subtilis)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)和Rhodosporium diobovatum可以防治番茄灰霉病[4-7]，并且已

有人将哈茨木霉菌株制成菌剂施用于大田，以控制番茄等作物灰霉病的发生[7-8]。本研究以番茄灰霉病病原菌为供试靶标菌，随机从福建、四川、陕西等地耕作土壤中筛选拮抗菌，采用平板对峙法、菌丝生长抑制法、孢子萌发法，对筛选拮抗菌的抑菌作用进行初步探索，并通过形态学特征、生理生化特征及16S rDNA 序列分

析对菌株进行鉴定，以期获得对番茄灰霉病有较强生防作用的拮抗芽孢杆菌。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 土样采集随机从福建、四川、陕西等地采集耕作土壤30份。

1.1.2 培养基牛肉膏蛋白胨培养基[9]：牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，氯化钠5.0 g，琼脂20 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.2。LB固体培养基[9]：蛋白胨10.0 g，氯化钠5.0 g，酵母膏10.0 g，琼脂20.0 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.0。LB液

体培养基[9]：蛋白胨10.0 g，氯化钠5.0 g，酵母膏10.0 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.2。PDA培养基[9]：去皮马铃薯200 g，蒸馏水1 000 mL，葡萄糖20 g，琼脂15 g，pH 7.0。

1.1.3 供试菌株番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)、稻瘟病菌(Pyricularia oryzae)、辣椒疫霉病菌(Phytophthora capsici Leonian)、苹果轮纹病菌(Physalospora piricola)、小麦根腐病菌(Bipolaris sorokiniana)、棉花枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp. vasinfectum)，均由西北农林科技大学植物病害综合治理实验室提供。

1.2 方法

1.2.1 拮抗芽孢杆菌的分离称取土壤样品10 g，倒入装有90 mL灭菌水的锥形瓶中，200 r/min振荡20 min，80 ℃水浴30 min，制成1∶10的土壤稀释液。从上述溶液中取出1 mL，加入9 mL无菌水充分振荡制成1∶102的稀释液。依此

类推，分别制成1∶103、1∶104、1∶105的土壤稀释液；静置后，取0.25 mL

上清液，用涂布器在LB平板上涂抹均匀，倒置于30 ℃恒温培养箱中培养2～4 d。纯化的细菌经革兰氏染色和芽孢染色，显示菌体呈杆状、产芽孢、革兰氏阳性的分离物为芽孢杆菌[10]。

1.2.2 拮抗芽孢杆菌的筛选采用平板对峙法[11]。将已培养3 d的病原真菌用5 mm打孔器打孔，将菌饼移到PDA培养基中央，将分离到的芽孢杆菌(已在30 ℃培养1 d)在离病原菌等距离的2个对角上接种，另2个对角上用清水作对照，28 ℃培养4 d，测量抑菌带的宽度，筛选效果最好的1株芽孢杆菌用于后续研究。

1.3 拮抗芽孢杆菌的抑菌活性

1.3.1 对菌丝生长的影响制备拮抗芽孢杆菌发酵培养滤液时，将拮抗芽孢杆菌接种于装有50 mL LB液体培养基的三角瓶中，30 ℃、220 r/min振荡培养48 h。收集发酵液，离心(10 000 r/min，4 ℃)，将上清液用0.22 μm滤膜过滤除菌即可

得到无菌发酵液。

采用菌丝生长速率法[12]，检测拮抗芽孢杆菌对番茄灰霉病菌、稻瘟病菌、辣椒疫霉病菌、苹果轮纹病菌、小麦根腐病菌、棉花枯萎病菌等供试病原真菌菌丝生长的影响。在无菌条件下，取制备好的芽孢杆菌无菌发酵液1 mL和融化的PDA培养

基9 mL混匀，在无菌培养皿中制成含发酵液的平板培养基，以不加发酵液的培养基为对照，在每个培养基表面放入1个直径5 mm的供试病原真菌菌饼，每处理

3次重复，28 ℃恒温培养3～4 d后，十字交叉法测量菌落直径，计算菌丝生长抑制率：菌丝生长抑制率=(对照菌落直径-处理菌落直径)/对照菌落直径×100%。

毒力测定时，将制备好的芽孢杆菌无菌发酵液，在无菌条件下用融化的PDA培养基依次配制成含0，5，10，20，50，100 mL/L发酵液的平板培养基，参照文献[12]的方法测定拮抗芽孢杆菌无菌发酵液对菌丝生长的毒力(EC50)。

1.3.2 对孢子萌发的影响采用孢子萌发法[13-15]，检测拮抗芽孢杆菌对供试病原

真菌孢子萌发的影响。取供试番茄灰霉病菌和稻瘟病菌孢子配成适当稀释度的孢子

悬液(100倍显微镜下，每个视野中可看到100个孢子)，将拮抗菌无菌发酵液与孢子悬浮液等体积混合，取1滴滴加在表面用火棉胶处理过的盖玻片上，使液滴倒

悬在保湿小环境中，每处理重复3次，以清水为对照。28 ℃下培养8～10 h后检查对照处理的孢子萌发情况(以孢子芽管长度大于孢子半径者判为萌发)，统计萌发率。当对照处理孢子的萌发率达到80%后，统计各处理的孢子萌发率，计算孢子

萌发抑制率：孢子萌发抑制率=(对照孢子萌发率-处理孢子萌发率)/对照孢子萌发

率×100%。在显微镜下观察拮抗芽孢杆菌无菌发酵液对病原菌孢子萌发的影响。

毒力测定时，在无菌条件下，制备拮抗芽孢杆菌发酵液分别为0，50，100，200，500 mL/L的供试病原真菌孢子悬浮液，参照文献[13-15]的方法测定拮抗菌无菌

发酵液对孢子萌发的毒力(EC50)。

1.3.3 对病原真菌菌丝形态的影响采用平板对峙法[16]，检测拮抗芽孢杆菌对供试病原菌菌丝形态的影响。在PDA平板中央接番茄灰霉病菌菌饼，在距平板中心3 cm的两侧接拮抗芽孢杆菌，28 ℃倒置培养3 d。观察靠近拮抗芽孢杆菌抑菌圈边缘的菌丝生长情况，以远离拮抗芽孢杆菌的边缘菌丝块为对照，显微镜下观察病原菌菌丝形态的生长情况。

1.4 拮抗芽孢杆菌的鉴定

(1) 菌体形态、培养特征观察及生理生化指标测定。参照柳凤等[17]的方法。

(2) 16S rDNA 序列分析与系统进化树的构建。参照Todorov等[18]的方法。以提取的拮抗芽孢杆菌基因组DNA为模板，以7f (5′-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3′) 和1540r (5′-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′)为上、下游引物扩增菌株的16S rDNA，PCR产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测后，送上海生工生物工程有限公

司测序，测序结果用BLAST软件在GenBank中进行同源性比较，并提交注册登

录号。以Clustal X进行多序列比对后，用MEGA 5.0的Neighbor-Joining法构建系统发育树，并进行1 000次Bootstraps检测。

1.5 数据分析

采用SPSS16.0软件中的Duncan方法对所有试验数据进行分析。

2 结果与分析

2.1 拮抗芽孢杆菌的筛选

从福建、四川、陕西等省耕作地采集的30份土壤样品中分离得到273株芽孢杆菌。经番茄灰霉病菌、稻瘟病菌、辣椒疫霉病菌、苹果轮纹病菌、棉花枯萎病菌、小麦根腐病菌等病原真菌筛选后，得到抗真菌活性较强的芽孢杆菌3株，其中LW-6-1菌株对番茄灰霉病菌的拮抗活性较好(图1)，故后续试验均以LW-6-1菌株为供试拮抗芽孢杆菌。

图1 LW-6-1对番茄灰霉病菌菌丝的拮抗作用Fig.1 Antimicrobial activity of

LW-6-1 against B.cinerea

2.2 LW-6-1的抑菌活性

2.2.1 对菌丝生长的抑制作用从表1可以看出，LW-6-1菌株无菌发酵液对供试番茄灰霉病菌、稻瘟病菌、辣椒疫霉病菌、苹果轮纹病菌、棉花枯萎病菌、小麦根腐病菌的菌丝生长均有明显的抑制作用，其中对番茄灰霉病菌、稻瘟病菌和辣椒疫霉病菌菌丝生长的抑制效果较好，抑制率分别为95.34%，92.56%和92.34%，

EC50分别为10.18，10.84和11.32 mL/L。

表 1 LW-6-1菌株无菌发酵液对不同病原真菌菌丝生长的抑制作用Table 1 Inhibitory rates of LW-6-1 fermentation solution against various pathogenic funguses病原真菌Pathogenicfungi菌丝生长抑制率

/%Inhibitoryrate毒力曲线ToxicityregressionequationrEC50/(mL·L-1)番茄灰

霉病菌B．cinerea95．34±2．01ay=3．6742+1．3245x0．965410．18稻瘟病菌P．oryzae92．56±2．13by=3．4980+1．4978x0．985310．84辣椒疫

霉病菌

P．capsiciLeonian92．34±3．12by=3．5469+1．4235x0．976111．32苹果轮纹病菌P．piricola80．78±3．90dy=2．9369+1．5536x0．986520．78小麦根腐病菌

B．sorokiniana91．20±3．14by=3．2546+1．4909x0．998415．23棉花枯萎病菌

F．oxysporumf．sp．vasinfectum86．65±3．43cy=3．2314+1．3589x0．9 97120．54

注:同列数据后标不同小写字母者表示在5%水平差异显著。

Note:Different lowercase letters in same columns indicate significant difference at 0.05 level.

2.2.2 对孢子萌发的抑制作用 LW-6-1菌株无菌发酵液对番茄灰霉病菌和稻瘟病菌孢子萌发抑制作用的测定结果见表2。从表2可以看出， LW-6-1菌株无菌发酵

液对供试的番茄灰霉病菌和稻瘟病菌的孢子萌发均有明显的抑制作用，其中对稻瘟病菌的EC50为2.67 mL/L，对番茄灰霉病菌的EC50仅为2.03 mL/L。

表 2 LW-6-1菌株无菌发酵液对不同病原真菌孢子萌发的抑制作用Table 2 Inhibition of the LW-6-1 fermentation solution against spore germination

of various pathogenic funguses病原真菌Pathogenicfungi孢子萌发抑制率/%Inhibitoryrate毒力曲线ToxicityregressionequationrEC50/(mL·L-1)番茄灰

霉病菌B．cinerea93．98y=4．2367+2．5340x0．99582．03稻瘟病菌P．oryzae92．09y=3．9087+2．7980x0．99532．67

观察发现，用LW-6-1菌株无菌发酵液处理的番茄灰霉病菌孢子基本未萌发，而

对照的孢子大多数都已萌发，且芽管很长(图2)。

图2 LW-6-1菌株无菌发酵液对番茄灰霉病菌孢子萌发的抑制作用(100×)A.对照；

B.LW-6-1无菌发酵液处理Fig.2 Inhibition of the LW-6-1 fermentation

s olution against spore germination of B.cinerea(100×)A.CK;B.Treatment of LW-6-1 fermentation solution

2.2.3 对番茄灰霉病菌菌丝形态的影响图3结果显示，对照菌丝生长细长而均匀，细胞结构较为清晰，且无膨大畸形现象(图3-A)。用LW-6-1菌株无菌发酵液处理的菌丝体膨大变粗，生长畸形，菌丝顶端和分枝处较为膨大，菌丝分枝增多(图3-

B)。

2.3 LW-6-1菌株的鉴定

2.3.1 LW-6-1菌株培养特性、形态学特征及生理生化特征在NA固体培养基上，LW-6-1菌落呈奶白色，菌落表面粗糙，边缘呈锯齿状。通过电镜观察可知，LW-6-1呈杆状，革兰氏阳性，周生鞭毛，单个细胞大小为(0.5～0.6) μm×(2.0～2.5) μm(图4)。结合拮抗菌株LW-6-1生理生化特征(表3)和该菌株的形态特征，初步鉴定LW-6-1菌株属于芽孢杆菌属。

图3 LW-6-1菌株无菌发酵液对番茄灰霉病菌菌丝形态的影响(400×)A．对照；

B.LW-6-1菌株无菌发酵液处理Fig.3 Effects of LW-6-1 fermentation solution on mycelia of B.cinerea(400×)A.CK;B.Treatment of LW-6-1 fermentation solution

图4 透射电镜(A)和扫描电镜(B)下LW-6-1菌株的形态Fig.4 LW-6-1 strain from transmission (A) and scanning (B) electron microscopy

表 3 LW-6-1菌株的生理生化特征Table 3 Physiological and biochemical characteristics of strain LW-6-1试验项目Testitems结果Results试验项目Testitems结果Results革兰氏染色Gramstain+接触酶Catalase+淀粉水解Starchhydrolysis+甲基红反应Methylred-厌氧生长

Anaerobicgrowth+7%NaCl-V⁃P测试V⁃Ptest+pH5．7+葡萄糖

Glucose+50℃-阿拉伯糖Arabinose+精氨酸双水解Argininedihydrolase-木糖

Xylose+龙胆二糖Gentiobiose+半乳糖Galactose-七叶灵Qiyeling+甘露糖Mannose+水杨苷Salicin+硝酸盐还原Nitratereduction+纤维二糖Cellobiose+柠檬酸盐Citratesolution-麦芽糖Maltose+明胶Hydrolysisofgelatin+松三糖Melezitose-酪朊水解Caseinatehydrolysis+木糖醇Xylitol-氧化酶Oxidase+肌醇Inositol+脂酶Lipase+甘露醇Mannitol+脲酶Urease+糖原Glycogen+

注:“+”表示阳性反应，“-”表示阴性反应。

Note:“+” Positive;“-” Negative.

2.3.2 16S rDNA序列分析与系统进化树以LW-6-1基因组DNA为模板，用引物7f和1540r进行PCR扩增，测得该菌株的16S rDNA核苷酸序列长度为1 454 bp，GenBank登录号为JX220980。通过与NCBI中模式菌株16S rDNA序列的比对分析和系统发育树的构建(图5)，得知LW-6-1菌株与甲基营养型芽孢杆菌Bacillus methylotrophicus CBMB205(T) (GenBank登录号为EU194897)的同源性最近，相似性为100%。综合菌株的培养特征、形态和生理生化特征及16S rDNA序列分析结果，可知LW-6-1菌株为甲基营养型芽孢杆菌Bacillus methylotrophicus。

图5 菌株LW-6-1的系统进化树Fig.5 Evolutional tree of strain LW-6-1

3 结论与讨论

本研究采用平板稀释法从采自福建、四川、陕西等地的30份土壤样品中分离得到273株芽孢杆菌，采用平板对峙法测定了其对6种病原真菌的抑菌活性，筛选得到1株具有较强拮抗活性的芽孢杆菌LW-6-1，根据菌株LW-6-1的培养特征、生理生化特征及16S rDNA序列分析结果，将菌株LW-6-1鉴定为甲基营养型芽孢杆菌Bacillus methylotrophicus。

本研究采用抑制菌丝生长速率法，测定了生防芽孢杆菌LW-6-1菌株发酵液对番

茄灰霉病菌、稻瘟病菌、辣椒疫霉病菌、苹果轮纹病菌、小麦根腐病菌、棉花枯萎病菌等6种病原真菌的抑菌活性，结果表明LW-6-1菌株对所有供试真菌均有较强的抑制作用，其中对番茄灰霉病菌、稻瘟病菌菌丝生长的抑制率达92%以上；毒力测定表明，LW-6-1菌株无菌发酵液对供试的6种病原真菌菌丝生长的EC50均小于21 mL/L，其中对番茄灰霉病菌、稻瘟病菌抑制菌丝生长的效果较好，抑制菌丝生长的EC50分别为10.18和10.84 mL/L。孢子萌发测定结果表明，LW-6-1菌株无菌发酵液抑制稻瘟病菌的EC50为2.67 mL/L，对番茄灰霉病菌的

EC50仅为2.03 mL/L。

芽孢杆菌是土壤和植物微生态的优势微生物种群，具有很强的抗逆能力和抗菌防病作用，许多性状优良的天然分离菌株已成功地应用于植物病害的生物防治。20世纪90年代初，美国Gustafson公司就以Epic、Kodiak为注册商标大量生产枯草芽孢杆菌杀菌剂，随后国际上多家公司相继推出了枯草芽孢杆菌杀菌剂[19]。在我国，从水稻上筛选的1株蜡质芽孢杆菌Bacillus cereus R2(取名为水稻丰收菌)，对水稻具有促进生长发育、控制病害、提早成熟和增加产量的作用[20]。近年来，番茄灰霉病等一些真菌性病害越来越严重，甚至导致毁园的严重后果，给番茄的生产造成了巨大的经济损失，因此新型生物杀菌剂的研发已经迫在眉睫。芽孢杆菌LW-6-1菌株是针对番茄灰霉病而筛选得到的生防菌株，其对番茄灰霉病有较强的生防效果，具有较大的研发潜力。本研究对LW-6-1菌株无菌发酵液的抗菌机制进行了一定探索，但关于其发酵液有效成分还需要进一步研究，这对研发新型杀菌剂以及发现新的先导化合物都具有十分重要的意义。

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