菘蓝莽草酸羟基肉桂酸酰转移酶IiHCT基因的克隆和表达分析

菘蓝莽草酸羟基肉桂酸酰转移酶IiHCT基因的克隆和表达分析根据菘蓝转录组数据，克隆了菘蓝莽草酸羟基肉桂酸酰转移酶IiHCT的全

长cDNA 并进行生物信息学分析，进一步利用实时荧光定量PCR技术分析了IiHCT基因的表达模式。IiHCT ORF为1 290 bp，编码430个氨基酸，等电点为5.77，相对分子质量为47.68 kDa。IiHCT主要在菘蓝茎中表达，幼根、叶、花蕾中几乎不表达。同时发现离体菘蓝毛状根中可以检测到IiHCT的表达，外源茉莉酸甲酯（MeJA）处理后，IiHCT相对表达量明显增加，在4 h 达到原先的4.3倍。研究首次从菘蓝中克隆得到HCT基因，为进一步解析菘蓝苯丙素类成分的生物合成途径奠定基础。

标签：菘蓝；莽草酸羟基肉桂酸酰转移酶；克隆；实时定量PCR；表达分析

[Abstract] Based on the transcriptome data，we cloned the open reading frame of IiHCT gene from Isatis indigotica，and then performed bioinformatic analysis of the sequence. Further，we detected expression pattern in specific organs and hairy roots treated methyl jasmonate（MeJA）by RT-PCR. The IiHCT gene contains a 1 290 bp open reading frame（ORF）encoding a polypeptide of 430 amino acids. The predicted isoelectric point（pI）was 5.7，a calculated molecular weight was about 47.68 kDa. IiHCT was mainly expressed in stem and undetectable in young root，leaf and flower bud. After the treatment of MeJA，the relative expression level of IiHCT increased rapidly. The expression level of IiHCT was the highest at 4 h and maintained two fold to control during 24 h. In this study，cloning of IiHCT laid the foundation for illustrating the biosynthesis mechanism of phenylpropanoids in I. indigotica.

[Key words] Isatis indigotica；HCT；cloning；Real-time PCR；expression analysis

doi：10.4268/cjcmm20152106

菘蓝Isatis indigotica Fort.为十字花科菘蓝属二年生草本植物。根和叶均可入药，分别称为板蓝根和大青叶。板蓝根和大青叶的提取物具有抗多种病毒的活性，但其所含化学成分比较复杂，目前已经证明具有抗病毒活性的单体（或类组分）仅有表告依春、2，4（1H，3H）-喹唑二酮、4（3H）-喹唑酮、糖蛋白、板蓝根多糖、板蓝根凝集素、直铁线莲宁B等[1-3]。其中最值得注意的是最近的研究证实直铁线莲宁B具有抑制不同亚型的流感病毒的活性，包括H1N1，H2N3和普通流感病毒等人流感病毒和H6N2，H7N3，H9N2等禽流感病毒[4]，也引起众多菘蓝活性成分生物合成研究者的关注。已有不同的研究组独立完成了菘蓝的转录组测序，并对菘蓝的多个次生代谢途径进行了初步解析[5-7]。

直铁线莲宁B合成的前体是松柏醇（coniferyl alcohol），基本途径是先通过苯丙烷途径合成松柏醇，在聚合蛋白酶（dirigent protein，DIR）作用下形成松

脂醇（pinoresinol），再在松脂醇还原酶（pinoresinol reductase，PLR）的催化下合成落叶松脂素（lanciresinol）。落叶松脂素都可以在UDP-糖基转移酶的作用下，可以被糖基化转为相应的糖苷，如落叶松脂素可以被转化为落叶松脂素-4，4′-二-O-β-D-二葡萄糖苷即直铁线莲宁B（clemastanin B）。最近菘蓝苯丙素类成分生源合成途径的主要关键酶基因被陆续克隆[8-9]，为菘蓝苯丙素类的生源合成和调控研究奠定了一定的基础。来源于拟南芥的研究发现，抑制莽草酸羟基肉桂酸酰转移酶（hydroxycinnamoyl-CoA shikimate/quinate hydroxycinnamoyl transferase，HCT）基因可以很大程度抑制p-coumaroyl-CoA向松柏醇（coniferyl alcohol）和芥子醇（sinapyl alcohol）方向转化[10]。而直铁线莲宁B的合成的前体是松柏醇，因此正向调控p-coumaroyl-CoA向松柏醇方向转化可能是提高菘蓝直铁线莲宁B 含量的有效途径，目前菘蓝的HCT基因尚未见报道。本研究克隆和分析菘蓝的HCT基因，为后续菘蓝直铁线莲宁B生物合成的定向调控研究提供候选基因。

1 材料

1.1 植物菘蓝自交纯系，每年北京郊区秋播。第2年春天收种。在七叶期分别剪取根、地上部分，以及抽薹时的茎和花蕾，液氮速冻，-80 ℃低温冰箱保存，用于提取总RNA。以发根农杆菌C58C1诱导的菘蓝毛状根，1/2MS+3%蔗糖液体培养基暗培养培养（28 ℃，80 r·min-1），每2周继代1次。1.2 试剂及仪器Plant RNA Reagent购自Life technologies，PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒购自TaKaRa宝生物工程（大连）有限公司，KOD plus neo 购自东洋纺（上海）生物科技有限公司，pEASY-Blunt Zero Cloning Kit购自北京全式金生物技术有限公司，SYBR Premix Ex Taq购自TaKaRa宝生物工程（大连）有限公司，脂糖凝胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒购均购自Axygen公司，茉莉酸甲酯（MeJA）购自Sigma-Aldrich，其他试剂为国产分析纯。本文所用引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，测序由上海美吉生物医药科技有限公司完成。本研究使用的PCR 扩增仪和7500 型实时荧光定量PCR系统均为美国Applied Biosystems 公司。nanodrop 2000紫外分光光度计为Thermo fisher 公司产品。

2 方法

2.1 菘蓝基因组DNA的微量提取剪取100 mg菘蓝叶片或毛状根，液氮研磨后采用SDS法基因组DNA，RNAseA去除RNA，最后溶于200 μL TE缓冲液（pH 7.4），1%琼脂糖电泳检测完整性。

2.2 总RNA 提取利用Plant RNA Reagent，按照操作说明书，分别提取不同组织和不同处理毛状根的总RNA，通过1%琼脂糖电泳检测RNA的完整性，利用nanodrop 2000紫外分光光度计确定RNA浓度。

2.3 全长cDNA 的克隆与测序采用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser先去除DNA，将总RNA 反转录成cDNA，作为Real-time PCR 和后续全长cDNA扩增的模板。利用拟南芥HCT基因蛋白序列信息，在菘蓝的转录组搜索，获得了菘蓝的HCT基因的cDNA全长序列。在此基础上利用Vector NTI 10