海参与活性肽研究

海参与活性肽研究
海参是海洋中重要的食物和药物资源，海参的体壁是海参的主要食( 药) 用部位。

近年来，人们发现海参含有许多具有重要生物学活性的物质，如多肽、海参黏多糖、海参皂苷、海参毒素、海参胶原蛋白、氨基酸、糖蛋白及活性钙等，但不含胆固醇。

生物活性肽是对生物体的生命活动有益或具有生理作用的肽类化合物，是蛋白质中20个天然氨基酸以不同组成和排列方式构成的从二肽到复杂的线形、环形结构的不同肽类的总称，是源于蛋白质的具有多种生物活性的化合物。

这些生物活性肽以非活性状态存在于蛋白质的长链中，当用适当的蛋白酶水解时，其活性被释放出来。

目前，大量的研究结果表明，生物活性肽具有多种生物学功能，如抗病毒、抗癌、抗血栓、抗高血压、免疫调节、激素作用、抑菌、降胆固醇等作用。

海参体壁中含有多种活性多肽，从海参上皮组织分离获得的由亮、脯、丝、精等氨基酸构成的五肽，具有抗肿瘤和抗炎活性。

此外，Moon等还从刺参分离得到1种糖蛋白质，能通过引起免疫反应而抑制动物移植瘤的生长。

Birenheide等从刺参体壁分离得到一些肽，对结缔组织的硬度具调控作用。

此外刺参中还含有很多游离氨基酸。

海参体壁蛋白质含量很高，主要为胶原蛋白，达到76.5％。

关于海参胶原蛋白的类型，迄今为止尚不清楚。

在水产无脊椎动物中分布较为广泛的胶原蛋白类型是类I型和类V型胶原，它们相当于脊椎动物I型胶原。

从氨基酸组成上看，海参胶原蛋白和其它棘皮动物的胶原蛋白比较相似，而与人体胶原蛋白之间存在着一些明显的差异。

基于海洋蛋白资源生长环境的特异性，其多肽链中存在功能、结构新颖的活性片段，选择合适的蛋白酶水解这些多肽链，把具有生物活性的肽片段释放出来，从而即可制备出具有各种生理功能的活性物质——海洋酶解生物活性多肽。

胶原蛋白多肽是胶原或明胶经蛋白酶等降解处理后制得的具有较高消化吸收性、分子量约为2000-30000的产物，不具有明胶的凝胶性能。

目前市场的胶原几乎都是胶原多肽。

最近，国外研究表明，胶原水解所得的胶原多肽不仅具有很好的消化特性，而且还具有许多生理活性功能。

如：抑制血压上升作用；保护胃粘膜以及抗溃疡作用；促进骨形成作用；促进皮肤胶原代谢；降低血清中胆固醇含量等。

近年来对水产胶原多肽研究较多的主要有ACE抑制肽、抗氧化肽、促进生长活性肽、抗疲劳肽、抗衰老肽、提高人体免疫肽及抗肿瘤肽等。

研究表明，胶原多肽可以在肠道直接被吸收，肽类和氨基酸以不同的途径被吸收，而且肽类比
氨基酸具有速度快、耗能低、不易饱和，且各种肽之间运转无竞争性与抑制性等特点。

多肽作为药物有其独特的优点：分子量小，无免疫原性，比较安全；分子较小，易于合成，成本低；结构相对简单，功能较明确，特异性强，副作用低；多肽药物易于多途径吸收；合成的多肽纯度高，不存在热原问题。

利用食物中的蛋白质，提取各种各样具有不同功能的活性多肽，作为食品的营养添加剂，改造传统食品，开发新的健康食品，已经是目前世界上许多生物学家和营养学家正在研究的热门课题。

1.生物活性肽的来源及制备
目前，生物活性肽的主要来源有：从生物体中分离的各类天然活性肽；酶解蛋白质产生的生物活性肽；通过化学方法或DNA重组技术合成的生物活性肽。

20世纪80年代末及90年代初出现的基因组合肽库和化学组合肽库，给肽类药物以及制药业带来了革命性的进展。

基因工程和蛋白质工程大大推动了生物活性肽的生产和应用。

我国对生物活性肽的研究主要集中在天然肽的分离和纯化上。

对基因组合肽库和化学组合肽库的构建、筛选及应用才刚刚起步。

其中酶解蛋白质生产活性肽以其技术成熟、投入较低，安全性极高,能在温和的条件下进行定位水解分裂产生特定的肽,且水解过程易控制,因而近几年报道的活性肽的制备方法皆为酶解法。

酶的选择是酶解法生产活性肽的关键,而目标活性肽的下游技术则是决定能否将之用于生产的关键。

因原料蛋白、所用酶类及分离精制方法的不同可得到不同的产品。

另外，微生物发酵法作为一种生产多肽的新方法，因其独特的优点而具有较好的开发前景。

1.1天然活性肽来源
天然生物活性肽分布很广泛，目前已经从人、动物、植物、微生物及部分海洋生物中分离出多种生物活性肽。

天然生物活性肽是筛选药物的天然资源宝库，通常具有高效、低毒、无污染等特点，在畜牧业、养殖业、食品业及药业中都有广泛的应用前景。

然而，生物活性肽在生物体内的含量一般是微量的，而且目前从天然生物体中分离纯化获得活性肽的工艺还不是很完善。

1.2化学合成法制备活性肽
美国著名化学家R B MERRIFIELD于1963年创建了经典固相多肽合成法并因此获得1984年诺贝尔化学奖。

该法主要是将带有氨基保护基的氨基酸的羧基端固定到不溶性树脂上，脱去该氨基酸上的氨基保护基，同下一个氨基酸的活化羧基形成酯键，从而延伸肽链形成多肽。

多肽固相合成法经过不断改进和完善，已经广泛用于多肽和蛋白质的研究领域，尤其是短肽的合成。

而其主要的缺点表现为直
接合成的序列短、耗时、合成效率和纯度低、成本高及合成试剂的毒性大等。

为了克服固相多肽合成法所面临的问题，科学家们研究出了蛋白质化学合成的片段连接法。

该方法在固相合成法制备适当长度的肽链的基础上，再结合液相合成的方法，在一定的条件下将不同的肽链相互连接而合成长肽链或是蛋白质。

然而，片段连接法通常需要对多片段中不希望参与反应的端基及侧链的功能基团加以保护，这样又带来含大量保护基的多肽片段不易纯化、相互连接时缩合效率低、连接产物难以分离等难点。

1.3 酶法制备活性肽
酶法制备生物活性肽是指利用蛋白酶直接水解蛋白质，分离纯化得到生物活性肽的过程。

利用蛋白酶制备生物活性肽可以使多肽产品具有良好的溶解性、耐酸和耐热稳定性及较高的速溶性等优点。

然而各种蛋白质的酶解过程中会产生苦味肽，影响了生物活性肽的实际应用。

研究表明，蛋白质水解产品中的苦味主要是由于酶解的过程使芳香侧链或长链烷基侧链的疏水性氨基酸残基暴露的结果。

如在大豆多肽的制备过程中发现，采用单一的酶水解大豆蛋白时，除了梨形毛霉蛋白酶水解物无苦味外，其他酶的水解物都有不同程度的苦味。

目前解决苦味的方法有：利用活性炭、硅藻土作为吸附剂分离脱苦；利用外切酶切除苦味肽；利用乙醇、丙醇和丁醇等进行醇提；利用β-环糊精、多磷酸盐和明胶等对低分子苦味肽进行络合处理。

然而上述方法再生困难、多肽和氨基酸损失较多，工序较为烦琐，成本较高。

为了克服单一酶解物所出现的苦味现象，不少学者采用了双酶或多酶水解的方式，正在不断的尝试克服这一难题。

例如目前在大豆多肽的制备过程中，主要采用双酶法或多酶法，以求去除苦味和改善大豆多肽的风味。

常见双酶组合有Alcalase和黑曲霉酸性蛋白酶组合、Alcalase和Neutrase组合；常见多酶组合有Flavourzyme和Prootamex组合、Alcalase和Flavourzyme组合。

然而蛋白酶在生物活性肽制备中的使用量大而且价格较贵，必将增加活性肽的制备成本。

1.4微生物发酵法制备活性肽
微生物法制备生物活性肽是指通过利用蛋白酶产生菌产酶水解蛋白，分离纯化得到生物活性肽的过程，其较酶法而言减少了蛋白酶的纯化和制备过程。

微生物法作为一种新的制备生物活性肽的方法，有其良好的优越性：微生物蛋白酶来源广、酶产量高、生长周期短、生产成本低。

与此同时，利用微生物法可以直接生产脱苦的活性肽，这样可以使蛋白的水解以及多肽的脱苦同步进行，实现一步法制备多肽，大大降低了成本：利用发酵法制备多肽，水解度为25％-30％，多肽得率为75％；与酶解法相比，得率提高l0％-20％，成本仅为酶解法的50％-60％。

微生物不仅可以直接发酵制备生物活性肽，而且可以提供廉价的商品酶，为生物活性肽的制备创造了良好的条件。

但微生物发酵法存在安全问题，目前用于食品
开发的蛋白酶生产源是有限的，主要有米曲霉、黑曲霉、枯草芽孢杆菌等，很多优良的产酶菌株被证明是有毒或是有害。

1.5活性肽制备的其他方法
随着生物活性肽研究的不断进行，有学者选择用酸碱来降解蛋白质。

虽然酸碱法制备生物活性肽工艺简单，但是具有氨基酸受损严重，水解程度难以控制，副产物较多，影响肽的结构及功能等缺点，故而限制了该方法的广泛应用。

分子生物学及相关技术的发展，基因重组的方法也在生物活性肽的制备中有所运用，但该方法还不够完善，例如会出现翻译后难以修饰，易形成包涵体等不恰当的折叠构型等不利情况。

2. 海洋生物活性肽的制备
自然存在于海洋生物中的活性肽(海洋天然生物活性肽) ,主要包括肽类抗生素、激素等生物体的次级代谢产物,骨骼、肌肉、免疫系统、消化系统、中枢神经系统中存在的活性肽等。

目前研究较多的有:鱼精蛋白、海绵多肽、海鞘多肽、海葵多肽、芋螺多肽、海藻多肽、鱼类多肽。

这些生物活性肽的制备主要靠直接提取法。

直接提取法是指应用各种分离纯化技术,直接从自然界生物体中把生物体本身所含有的生物活性肽提取出来。

直接提取法制备的海洋生物活性肽由于肽含量低,要获得较高纯度的产物,必然要经过多次抽提和精炼步骤,将造成很高的加工制造成本,导致资源的浪费;而且由于人类需求较大,可能引发某物质资源的耗竭;此外提取过程必然需要使用大量的有机溶剂,这些有机溶剂将造成对生活环境的污染,也将导致所提取的生物活性肽中存在有机溶剂残留而带来毒性等问题。

基于海洋蛋白资源生长环境的特异性,其多肽链中存在功能、结构新颖的活性片段,选择合适的蛋白酶水解这些多肽链,把具有生物活性的肽片段释放出来,从而即可制备出具有各种生理功能的活性物质——海洋酶解生物活性多肽。

蛋白酶降解法生产活性肽安全性极高,能在吻合的条件下进行定位水解分离产生特定的肽,且水解过程易控制,因而是主要的活性肽制备方法,其中酶的选择、酶解过程的控制是关键。

优点在于原料廉价,成本低,安全性好,不需要很高级的实验条件和很贵重的仪器设备,便于工业化生产。

3. 酶解胶原蛋白制备海参胶原蛋白多肽的工艺方法：
方法1：鲜海参→70 ℃速冻→剪切机切片→胶体磨研磨胶体化→加入蛋白酶水解→煮沸灭酶→加入95%的乙醇至体系达60%乙醇度→静止12h 一离心→沉淀〔海参粗多糖) →上清液（海参多肽混合物)
粗多糖→5 %的水溶液→离心取上清液→双氧水氧化脱色→乙酸钾法除蛋白→冷藏过夜→离心收集沉淀→洗涤→精多糖
海参多肽混合物→超滤法纯化→脱苦脱色→冷冻干燥→海参多肽粉末
方法2：干参经60℃水发2d后，每天换水4-5次，于40℃乙醇中连续浸提6d，每天更换新鲜乙醇，最后于常温下晾干。

干物以风味酶酶解4h(酶与底物比为1:4、pH6.5、温度45℃)，经煮沸灭酶后，迅速冷却至室温，5000rpm离心30 min，上清液加乙醇沉淀过夜。

离心后，上清液依次用截留分子量为2KD和10KD的超滤膜进行超滤处理，得到分子量范围为(2-10)KD海参胶原蛋白多肽酶解液。

40℃旋转挥发、浓缩、真空冻干，得胶原蛋白多肽粉末。

刺参胶原蛋白多肽用D-Hanks 配成2mg／mL母液，过滤除菌、分装，-20℃保存，临用时用培养液调制。

4. 海参常用加工工艺
煮参：将活海参去内脏洗净，放入大开水锅内煮30分钟左右，待参皮皮紧、刺硬时捞出。

煮时要勤翻动和去掉浮沫，防止海参贴在锅底化皮。

腌渍：将煮过的海参凉透后，加盐拌匀盛入大瓷缸，缸口用一层厚盐封严，腌渍15天以后出缸。

腌渍过程要隔几天检查一次，如发现海参发烧，汤色变红，应立即加盐或回锅煮，如正常，检查完后仍加盐封顶。

烤参：将腌渍参的原汤加入15%的盐放入锅中烧开，再将参下锅煮30-50分钟并随时翻动，将参捞出时表面立即显干，并有盐粒结晶，即可出锅，发现参体
有水泡应立即刺破。

拌灰：将烤好的参趁热加灰，为使海参着色黑且干得快，最好用柞木碳和松木碳碾成的灰。

用草木灰亦可，但拌出的参体色较浅且干的较慢。

晒干：将拌匀灰的参晾晒，每2-3天收回库中回潮，反复进行3-4次，直至充分干燥，即为成品。

加工出成率，每100公斤鲜参加工干参6公斤左右。