3种石斛兰以茎段为外植体的离体快繁技术1)

关键词 肿节石斛；尖刀唇石斛；报春石斛；离体培养；生根 分类号 Ｓ６８２．３１
Ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｈｒｅｅ Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ Ｓｐｅｃｉｅｓ ｆｒｏｍ Ｓｔｅｍｓ ／Ｌｉ Ｙｕａｎ， Ｚｈｕ Ｄａｎｈｏｎｇ， Ｐａｎ Ｈｕｉｔａｎｇ， Ｚｈａｎｇ Ｑｉｘｉａｎｇ
（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｆｌｏｒｉｃｕｌｔｕｒｅ， Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００８３， Ｐ．Ｒ．Ｃｈｉｎａ） ／／
增殖系数
２．０６±０ ．１７ ３．０７±０ ．３１ ３．２８±０ ．１８ ２．６６±０ ．２１ ２．２９±０ ．２６ ３．３９±０ ．３６ ３．７５±０ ．２３ ２．５７±０ ．２３ ２．７７±０ ．１６ ４．２３±０ ．３５ ４．０１±０ ．３２ ２．３４±０ ．２２ ３．０４±０ ．１４ ３．９１±０ ．２１ ３．１５±０ ．２８ ２ ．１２ ±０．１４
第 ４１ 卷 第 ８ 期 ２０１３ 年 ８ 月
东 北 林 业 大 学 学 报 ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＮＯＲＴＨＥＡＳＴ ＦＯＲＥＳＴＲＹ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ
Ｖｏｌ．４１ Ｎｏ．８ Ａｕｇ．２０１３
３ 种 石 斛 兰 以 茎 段 为 外 植 体 的 离 体 快 繁 技 术 １）
李 媛 朱丹红 潘会堂 张启翔
待 ３ 种石斛兰生长至株高 ３ ～４ ｃｍ，生根 ２ ～４ 根，根长 １ ～２ ｃｍ 时，将组培瓶移至温室炼苗 １ ｗ，再 打开瓶口炼苗 ２ ～３ ｄ，温度控制在 ２３ ～３０ ℃，湿度 ８０％ ～９０％。 炼苗完成后取出小苗，洗去根部残留 的培养基，用 １ ０００ 倍多菌灵浸泡处理过 １２ ｈ 的水 苔包裹小苗根部进行上盆，保持温度和湿度，做部分 遮荫处理并加盖塑料膜保湿，３０ ｄ 后统计炼苗移栽 的成活率。 １．６ 数据统计与分析
６０
０．２５ ０．２５
１００
０
０．２５ ０．５０
６０
１００
０．５０ ０
６０
６０
０．５０ ０．１０
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３０
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０
０．７５ ０
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０．７５ ０．２５
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６０
０．７５Biblioteka Baidu０．５０
０
３０
诱导 率 ／％
３８ ．７５ ５６ ．２５ ４８ ．７５ ４５ ．００ ６３ ．７５ ８６ ．２５ ７１ ．２５ ６１ ．２５ ５７ ．５０ ９３ ．７５ ７６ ．２５ ５３ ．７５ ６８ ．７５ ７２ ．５０ ５６ ．２５ ４７ ．５０
所用外源添加物如椰乳为新鲜椰子汁液；土豆 泥：土豆洗净带皮切块煮熟，用搅拌机打碎成泥状； 香蕉泥：成熟香蕉去皮，用搅拌机打成泥状。 １．４ ３ 种石斛兰生根培养基的筛选 １．４．１ ＮＡＡ 质量浓度对不定芽生根的影响
待 ３ 种石斛兰的不定芽长至 １ ～２ ｃｍ 时，在超 净工作台上打开培养瓶，将不定芽从基部切下转接 到 ＭＳ＋ＮＡＡ（０、０．２５、０．５、０．７５ ｍｇ ／Ｌ） ＋蔗糖 ２０ ｇ ／Ｌ＋ 琼脂 ６．５ ｇ ／Ｌ 的生根诱导培养基上，每瓶接种外植 体 ４ 个，每个组合 １０ 瓶。 ４０ ｄ 后统计不定芽的生根 率、平均根数、根长度、根粗度等数据，筛选出适合 ３ 种石斛兰不定芽生根的 ＮＡＡ 质量浓度。 １．４．２ 外源添加物对不定芽生根的影响
１．３ ３ 种石斛兰不定芽诱导培养基的筛选 以 １ ／２ＭＳ 为基础培养基，再附加不同质量浓度
的 ６－ＢＡ（０、 ０．２５、 ０．５、 ０．７５ ｍｇ ／Ｌ），ＮＡＡ（０、 ０．１、 ０．２５、０．５ ｍｇ ／Ｌ），椰乳（０、３０、６０、１００ ｍＬ ／Ｌ） 和土豆 泥（０、３０、６０、１００ ｇ ／Ｌ）。 采用正交试验设计，将外植 体接种于 １６ 个培养基组合上，每瓶接种外植体 ４ 个，每个组合 ２０ 瓶。 ４０ ｄ 后统计不定芽诱导率和增 殖系数，筛选出 ６ －ＢＡ、ＮＡＡ、椰乳和土豆泥的适合 组合。
控［１３－１４］ 和育种［ １５－１６］ 等研究。 研究所选肿节石斛和 尖刀唇石斛均未见有离体快繁方面的报道，报春石 斛离体繁殖缺乏激素和外源添加物对植株再生的作 用的研究。 本研究拟利用 ３ 种石斛兰无菌茎段为外 植体诱导不定芽，研究离体培养快繁技术，以期建立 高效、稳定的组培再生体系，为 ３ 种石斛兰快速繁殖 和种质资源保存提供有效的方法。
试 验所用培养基均添加蔗 糖２０ ｇ · Ｌ－１ 、 琼脂 ６．５ ｇ· Ｌ－１ ，ｐＨ 值调至 ５．６。 培养温度为（２４±２） ℃， 采用日光灯做培养光源，光照强度 １ ０００ ｌｘ，光照周 期 １２ ｈ· ｄ－１ 。
７８
东 北 林 业 大 学 学 报 第 ４１ 卷
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｏｒｔｈｅａｓｔ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ．－２０１３，４１（８）．－７７－８１
Ａｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ ｐｅｎｄｕｌｕｍ， Ｄ．ｈｅｔｅｒｏｃａｒｐｕｍ ａｎｄ Ｄ．ｐｒｉｍｕｌｉｎｕｍ ｗａｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｗｉｔｈ ｓｔｅｒｉｌｅ ｓｔｅｍｓ ａｓ ｅｘｐｌａｎｔｓ ｂｙ ｓｉｎｇｌｅ ｆａｃｔｏｒ ａｎｄ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｄｅｓｉｇｎ．Ｓｈｏｏｔ ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｏｏｔｉｎｇ ｗｅｒｅ ｉｎｖｅｓｔｉ－
１） 国家科技支撑计划（２０１２ＢＡＤ０１Ｂ０７） 。 第一作者简介：李媛，女，１９８８ 年 １２ 月生，国家花卉工 程技 术研 究中心（ 北京林业大学） ，硕士研究生。 通信作者：张启翔，国 家 花 卉 工 程 技 术 研 究 中 心 （ 北 京 林 业 大 学） ，教授。 Ｅ－ｍａｉｌ：ｚｑｘｂｊｆｕ＠１２６．ｃｏｍ。 收稿日期：２０１２ 年 １０ 月 ２３ 日。 责任编辑：潘 华。
不定芽诱导试验结果说明，当 ６ －ＢＡ 质量浓度 达到 ０．５ ｍｇ ／Ｌ、ＮＡＡ 质量浓度在 ０．１ ～０．２５ ｍｇ· Ｌ－１ 时，不定芽诱导率、增殖系数和生长状况均达到 最高值。 增殖系数随着椰乳体积分数的增加而增 大，当椰乳达到 １００ ｍＬ 时达到最大。 另外，不定芽 的生长状况与椰乳的体积分数呈正相关，土豆泥对 不定芽诱导率和增殖系数影响不大（表 １、表 ２）。
不定芽诱导率 ＝出芽外植体数 ／接种外植体数× １００％；不定芽增值系数 ＝增殖后芽数 ／接种外植体 数×１００％；生根率 ＝生根不定芽数 ／接种不定芽数× １００％；生根数 ＝生根根数 ／生根不定芽数×１００％。
２ 结果与分析
２．１ 不同质量浓度 ６－ＢＡ、ＮＡＡ 和外源添加物对不 定芽诱导影响
２．１．１ 不同质量浓度 ６－ＢＡ、ＮＡＡ 和外源添加物对 肿节石斛不定芽诱导的影响
在筛选出的合适质量浓度 ＮＡＡ 的生根培养基 中，再分别添加椰乳 （１００ ｍＬ ／Ｌ）、 土 豆 泥 （１００ ｇ ／ Ｌ）、香蕉泥（１００ ｇ ／Ｌ），每瓶接种外植体 ４ 个，每个组 合 １０ 瓶。 ４０ ｄ 后统计不定芽的生根率、平均根数、 根长度、根粗度等数据，筛选出适合 ３ 种石斛兰不定 芽生根的培养基。 １．５ ３ 种石斛兰炼苗移栽
１ 材料与方法
１．１ 外植体的获得 供试的肿节石斛、尖刀唇石斛和报春石斛皆为
野生原种，由北京植物园引自云南，在温室内盆栽 ２ ａ 以上。 采收发育成熟的蒴果，在北京林业大学实 验室进行无菌播种培养。 待发育成为 ４ ～６ ｃｍ 的植 株后，在超净工作台上将植株切成长 １ ～１．５ ｃｍ 带 有茎节的茎段作为外植体备用。 １．２ 培养条件
表 １ ６－ＢＡ、ＮＡＡ 质量浓度和外源添加物对肿节石斛不定 芽诱导的影响
激素质量浓度 ／ 外源添加物
ｍｇ· Ｌ －１
椰乳 ／ 土豆泥 ／
６ －ＢＡ ＮＡＡ ｍＬ· Ｌ －１ ｇ· Ｌ－１
０
０
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０
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０ ．１０
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６０
０．２５ ０
３０
３０
０．２５ ０．１０
０
ｇａｔｅｄ ｔｏ ｓｃｒｅｅｎ ｐｅｒｆｅｃｔ ｍｅｄｉｕｍｓ ａｎｄ ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．Ｔｈｅ ｂｅｓｔ ｓｈｏｏｔ ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ ｏｆ Ｄ．ｐｅｎｄｕｌｕｍ ａｎｄ Ｄ． ｐｒｉｍｕｌｉｎｕｍ ｉｓ １ ／２ＭＳ ｍｅｄｉｕｍ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ ｗｉｔｈ ０．５ ｍｇ· Ｌ－１ ６－ＢＡ， ０．１ ｍｇ· Ｌ－１ ＮＡＡ ａｎｄ １００ ｍｌ· Ｌ－１ ＣＷ， ａｎｄ ｔｈｅ ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｒａｔｅｓ ａｒｅ ９３．７５％ ａｎｄ ９０．００％， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ ｂｅｓｔ ｓｈｏｏｔ ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ ｏｆ Ｄ．ｈｅｔｅｒｏｃａｒｐｕｍ ｉｓ １ ／２ＭＳ ｍｅ－ ｄｉｕｍ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ ｗｉｔｈ ０．２５ ｍｇ· Ｌ－１ ６－ＢＡ， ０．１ ｍｇ· Ｌ－１ ＮＡＡ ａｎｄ １００ ｍｌ· Ｌ－１ ＣＷ， ａｎｄ ｔｈｅ ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｒａｔｅｓ ｗｅｒｅ ９５．００％． Ｔｈｅ ｂｅｓｔ ｒｏｏｔｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ ｏｆ Ｄ．ｐｅｎｄｕｌｕｍ ａｎｄ Ｄ．ｈｅｔｅｒｏｃａｒｐｍｕ ｉｓ ＭＳ ｍｅｄｉｕｍ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ ｗｉｔｈ ０．５ ｍｇ· Ｌ－１ ＮＡＡ ａｎｄ １００ ｇ· Ｌ－１ Ｂａｎａｎａ Ｊｕｉｃｅ．Ｔｈｅ ｂｅｓｔ ｒｏｏｔｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ ｏｆ Ｄ．ｐｒｉｍｕｌｉｎｕｍ ｉｓ ＭＳ ｍｅｄｉｕｍ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ ｗｉｔｈ ０．７５ ｍｇ· Ｌ－１ ＮＡＡ ａｎｄ １００ ｇ· Ｌ－１ ｍａｓｈｅｄ ｐｏｔａｔｏ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｒｏｏｔｉｎｇ ｒａｔｅ ｏｆ １００％．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ ｐｅｎｄｕｌｕｍ； Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ ｈｅｔｅｒｏｃａｒｐｕｍ； Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ ｐｒｉｍｕｌｉｎｕｍ； Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｃｕｌｔｕｒｅ； Ｒｏｏｔｉｎｇ
肿节石斛（ Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ ｐｅｎｄｕｌｕｍ）、尖刀唇石斛 （Ｄ．ｈｅｔｅｒｏｃａｒｐｕｍ）和报春石斛（Ｄ．ｐｒｉｍｕｌｉｎｕｍ） 均属 兰科石斛属，多年生草本附生兰。 ３ 种石斛兰均为 国家二级保护植物，其中报春石斛属于枟 中国物种 红色名录枠 的濒危（ ＥＮ） 级别［１］ 。 肿节石斛花大、美 丽，茎节膨大奇特，气味芬芳；尖刀唇石斛姿态优美， 花朵淡雅，具香气；报春石斛花姿秀丽，色彩明艳，都 是观赏春石斛杂交育种的重要亲本。 ３ 种石斛具有 极高的观赏价值，但自然状态下繁殖困难，种子萌发 率极低，传统分株繁殖周期长，效率低。 组织培养能 够实现石斛兰的高频增殖，自 １９６０ 年 Ｇｍｏｒｅｌ 利用 石斛 Ｄ．ｎｏｂｉｌｅ 茎尖培养出无菌植株后， 国内也在 １９８４ 年首次报道获得 Ｄ．ｈｕｏｓｈａｎｅｎｓｅ 的试管苗［２］ 。 目前，有关药用石斛的研究比较广泛，但观赏石斛的 报道相对较少。 研究内容主要包括石斛的细胞学研 究 、 ［３－５］ 栽 培 繁 殖 、 ［６－７］ 离 体 快 繁 、 ［８－１２］ 花 期 调
（ 国家花卉工程技术研究中心（ 北京林业大学） ，北京，１０００８３）
摘 要 以肿节石斛（Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ ｐｅｎｄｕｌｕｍ）、尖刀唇石斛（Ｄ．ｈｅｔｅｒｏｃａｒｐｕｍ） 和报春石斛（ Ｄ．ｐｒｉｍｕｌｉｎｕｍ） 的无 菌茎段为外植体，通过正交试验和单因子试验，研究不定芽诱导、生根和炼苗移栽等技术，筛选出各培养阶段的适 宜培养基配方和培养条件，建立 ３ 种石斛兰离体快繁体系。 结果表明：适合肿节石斛和报春石斛不定芽诱导的培 养基为 １ ／２ＭＳ＋６－ＢＡ ０．５ ｍｇ· Ｌ－１ ＋ＮＡＡ ０．１ ｍｇ· Ｌ－１ ＋椰乳 １００ ｍＬ· Ｌ－１ ，诱导率分别为 ９３．７５％和 ９０．００％；适合 尖刀唇石斛不定芽诱导的培养基为 １ ／２ＭＳ＋６－ＢＡ ０．２５ ｍｇ· Ｌ－１ ＋ＮＡＡ ０．１ ｍｇ· Ｌ－１ ＋椰乳 １００ ｍＬ· Ｌ－１ ，诱导率达到 ９５．００％。 适合肿节石斛和尖刀唇石斛生根的培养基为 ＭＳ＋ＮＡＡ ０．５ ｍｇ· Ｌ－１ ＋香蕉泥 １００ ｇ· Ｌ－１ ，适合报春石斛 生根的培养基为 ＭＳ＋ＮＡＡ ０．７５ ｍｇ· Ｌ－１ ＋土豆泥 １００ ｇ· Ｌ－１ ，生根诱导率高达 １００％。