小鼠单克隆抗体的制备与纯化

小鼠单克隆抗体的制备与纯化

关键词：细胞骨髓瘤细胞 B细胞培养基试剂标准物质北京标准物质网

小鼠单克隆抗体的制备与纯化一般可分为细胞融合、阳性杂交瘤细胞的筛选与单克隆化、单克隆抗体的生产与纯化等过程。

1.细胞融合动物免疫方法与抗血清制各相同。为保证得到的B细胞有较强的分泌抗体活性，在融合前3天须进行一次静脉加强免疫。融合时小鼠骨髓瘤细胞(如SP2／0-Ag14细胞株)要处于对数分裂期的良好生长状态，对在无菌条件下获得的小鼠脾脏B细胞需用无血清培养液洗2至3遍，以去除小鼠血清。融合时脾细胞和骨髓瘤细胞的比例一般为5：1至10：1，常用的融合剂为50%的聚乙二醇，完成融合后要用培养液缓慢稀释后离心，除去PEG，然后将细胞用HAT选择培养基(RPMI1640含10%～20％胎牛或小牛血清和HAT悬浮后接种于96孔板中。正常情况下在融合后的第3、4天在光镜下即可看到克隆的生长，在第10

天后可以进行筛选。

PEG虽融合效率较低，但方法简单，成本低廉，故较为常用。电融合虽融合率较高，但一次融合的细胞数少，且需专门设备，故较少使用。在融合后的细胞培养过程中，可同时添加同种动物的腹腔细胞(即饲养细胞)，其中的吞噬细胞能清除死亡细胞碎片，有助于杂交瘤细胞的生长。商品化的杂交瘤细胞生长因子，也可以促进杂交瘤细胞的生长。

2.阳性杂交瘤细胞的筛选与单克隆化杂交细胞经约10～14天培养后(此间要换培养液1～2次)可进行筛选，ELISA是最常用的筛选方法。对获得的阳性克隆细胞要通过有限稀释法进行亚克隆，以保证抗体分泌细胞来源于单个细胞。由于融合细胞的染色体容易发生丢失，故一般要通过数次亚克隆，直至来自同一克隆的所有亚克隆细胞均为反应阳性，表明该克隆的抗体编码基因已较稳定，可以扩大培养并建株。

3.单克隆抗体的扩大生产采用什么方法进行单克隆细胞株的扩大培养及抗体制备，取决于实际需要。目前生产大量单克隆抗体的常用方法有小鼠腹水制备、大瓶培养和中空纤维反应器三种，前者多用于实验室制备，后二者适用于工厂化生产。腹水制备方法成本低，但因腹水中杂蛋白多，易使抗体失活，故腹水收集后应尽快纯化，以防止抗体降解。大瓶培养获得的上清体积大，但抗体浓度低，培养成本和抗体纯化成本均较高。相对于大瓶培养，利用中空纤维反应器进行单克隆抗体生产是比较经济的方法，但设备装置的费用投入较大。

对实验室研究或非药物性抗体生产而言，通过腹水制各及蛋白A或蛋白G 的纯化获得的抗体己能基本满足需要。杂交瘤培养上清的抗体浓度一般为每毫升微克级，可直接用于免疫印迹、免疫沉淀等实验。用特殊的无血清培养基进行杂交瘤培养，也可较为容易地获得一般实验的抗体需要量。