酶与细胞的固定化1

凝胶的孔径应控制在小于酶分子或细胞直径的范围 内。所以该方法不适用于那些底物或产物分子很大的 酶类的固定化。 酶类的固定化。 半透膜包埋法：微囊型， 2. 半透膜包埋法：微囊型，适合于底物和产物都为小分 子物质的酶的固定化。 子物质的酶的固定化。
微胶囊
脂质体包埋
（四）各种固定化方法的比较
特性 制备 结合力 酶活力 底物专一性 再生 固定化费用 物理吸附 法 容易 中 高 无变化 可 能 低 离子键结 合法 容易 弱 高 无变化 可 能 低 包埋法 容易 强 高 无变化 不可能 中 共价结 合法 困难 强 中 有变化 交联法 困难 强 中 有变化
原因：载体对反应液中H+或OH-的选择性吸引作用。 原因：载体对反应液中 的选择性吸引作用。
b. 产物性质对最适 的影响： 产物性质对最适pH的影响： 的影响 产物为酸性→最适 向碱性一侧移动 向碱性一侧移动； 产物为酸性→最适pH向碱性一侧移动； 产物为碱性→最适 向酸性一侧移动 向酸性一侧移动； 产物为碱性→最适pH向酸性一侧移动； 产物为中性→最适 一般不移动 一般不移动。 产物为中性→最适pH一般不移动。
硅藻土
羟基磷灰石
活性炭
特点：操作简便，条件温和， 特点：操作简便，条件温和，不会引起酶变性失活或 细胞结构的改变，载体廉价易得且可反复使用。 细胞结构的改变，载体廉价易得且可反复使用。但结 合力较弱，因而使用受限。 合力较弱，因而使用受限。
4．离子键结合法： 离子键结合法： 载体：某些不溶于水的离子交换剂，如DEAE-纤维 载体：某些不溶于水的离子交换剂， 纤维 纤维素， 葡聚糖凝胶等。 素， TEAE-纤维素，DEAE-葡聚糖凝胶等。 纤维素 葡聚糖凝胶等
特点：结合牢固，酶不会脱落， 特点：结合牢固，酶不会脱落，可连续使用较长时ຫໍສະໝຸດ Baidu但载体活化的操作复杂，比较麻烦。 间，但载体活化的操作复杂，比较麻烦。同时由于共 价结合时可能影响酶的空间构象而影响酶的催化活 性。 2．交联法：借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用 交联法： 制成网状结构的固定化酶方法。 制成网状结构的固定化酶方法。 试剂：戊二醛，己二胺，顺丁烯二酸酐等。 试剂：戊二醛，己二胺，顺丁烯二酸酐等。
原因：固定化载体成为扩散障碍， 原因：固定化载体成为扩散障碍，致使固定化酶所处 催化区域的pH值发生改变，故周围反应液的 值也 催化区域的 值发生改变，故周围反应液的pH值也 值发生改变 应发生变化，才能达到酶所要求的pH值 应发生变化，才能达到酶所要求的 值。
底物特异性： 4．底物特异性： 变化与底物分子量的大小有一定关系。 变化与底物分子量的大小有一定关系。 原因：由于载体的空间位阻效应而引起。 原因：由于载体的空间位阻效应而引起。酶固定在载 体上以后， 体上以后，使大分子底物难于接近酶分子而使催化速 度大大降低。 度大大降低。而分子量较小的底物受空间位阻作用的 影响较小或不受影响，因而与游离酶的作用没有显著 影响较小或不受影响， 不同。 不同。 酶活力： 5．酶活力： 多数情况下比天然酶小，其专一性也能发生改变； 多数情况下比天然酶小，其专一性也能发生改变；
酶的固定化方法 固定化方法 分类 固定化方法 化学结合法 分类 共价结合法 交联法 包埋法 微囊法 网格法
非共价结合法 结晶法 分散法 物理吸附法 离子键结合法
（一）非共价结合法 1．结晶法：使酶结晶从而实现固定化的方法； 结晶法：使酶结晶从而实现固定化的方法； 特点：特别适合于活力低的酶的固定。 特点：特别适合于活力低的酶的固定。但在不断的重 复循环中，酶会有损耗，从而使得固定化酶浓度降低。 复循环中，酶会有损耗，从而使得固定化酶浓度降低。 2．分散法：通过酶分子分散于水不溶相中从而实现固定 分散法： 化的方法； 化的方法； 方法：直接将干粉悬浮于溶剂中， 方法：直接将干粉悬浮于溶剂中，并可以通过过滤和 离心的方法将酶进行分离和再利用。 离心的方法将酶进行分离和再利用。
特点： 特点： 结合牢固，制得的固定化酶可长时间使用。 结合牢固，制得的固定化酶可长时间使用。但交联反应 条件剧烈，酶分子的多个基团被交联， 条件剧烈，酶分子的多个基团被交联，使酶活力损失较 而且制备成的固定化颗粒较小，给使用带来不便。 大，而且制备成的固定化颗粒较小，给使用带来不便。
包埋法：将酶或细胞包埋在各种多孔载体中， （三）包埋法：将酶或细胞包埋在各种多孔载体中，使酶 或细胞固定化的方法。 或细胞固定化的方法。 凝胶包埋法： 1．凝胶包埋法：
与完整细胞相比不适宜于多酶反应， 4．与完整细胞相比不适宜于多酶反应，特别是需要辅助 因子的反应； 因子的反应； 胞内酶必须经过酶的分离手续。 5．胞内酶必须经过酶的分离手续。 三．固定化酶的制备原则 必须注意维持酶的催化活性及专一性； 1．必须注意维持酶的催化活性及专一性；
保护酶的活性中心：尽量保护酶的催化作用， 保护酶的活性中心：尽量保护酶的催化作用，并使酶 的活性中心的氨基酸基团固有的高级结构不受到损害。 的活性中心的氨基酸基团固有的高级结构不受到损害。 在制备固定化酶时，需要在非常严格的条件下进行， 在制备固定化酶时，需要在非常严格的条件下进行， 避免用高温、强酸、强碱等处理， 避免用高温、强酸、强碱等处理，而且操作应尽量在 非常温和的条件下进行。避免使用有机溶剂、 非常温和的条件下进行。避免使用有机溶剂、高浓度 的盐等使酶变性失活的条件。 的盐等使酶变性失活的条件。 保护酶的功能基团：如游离的氨基、羧基、 保护酶的功能基团：如游离的氨基、羧基、半胱氨酸 的巯基、组氨酸的咪唑基、酪氨酸的酚基、 的巯基、组氨酸的咪唑基、酪氨酸的酚基、丝氨酸和 苏氨酸的羟基等，当这些功能基团位于酶的活性中心 苏氨酸的羟基等，当这些功能基团位于酶的活性中心 要求不参与酶的固定化结合。 时，要求不参与酶的固定化结合。
特点：条件温和，操作简便。但结合力较弱， 特点：条件温和，操作简便。但结合力较弱，且条件 改变时，易脱落下来。 改变时，易脱落下来。
(二）化学结合法 共价键结合法： 1．共价键结合法： 载体：纤维素，琼脂糖凝胶，甲壳素等。 载体：纤维素，琼脂糖凝胶，甲壳素等。 过程：首先使载体活化， 过程：首先使载体活化，即借助于某种方法在载体上 引进某一活泼基团。 引进某一活泼基团。然后这一活泼基团再与酶分子上 的某一基团反应，形成共价键。 的某一基团反应，形成共价键。
原因： 原因： 酶分子在固定化过程中，空间构象会有所变化， ①酶分子在固定化过程中，空间构象会有所变化，甚至 影响了活性中心的氨基酸； 影响了活性中心的氨基酸； 固定化后，酶分子空间自由度受到限制（ ②固定化后，酶分子空间自由度受到限制（空间位 阻）； ③内扩散阻力使底物分子与活性中心的接近受阻； 内扩散阻力使底物分子与活性中心的接近受阻； ④包埋时酶被高分子物质半透膜包围，大分子底物不能 包埋时酶被高分子物质半透膜包围， 透过膜与酶接近。 透过膜与酶接近。
第五章 酶与细胞固定化 (P179)
酶在实际应用中的缺陷 酶的稳定性差，容易变性失活； 1．酶的稳定性差，容易变性失活； 2．酶在反应系统中与底物和产物混在一起，不便于酶的 酶在反应系统中与底物和产物混在一起， 回收利用。这不仅使使用酶的成本增加， 回收利用。这不仅使使用酶的成本增加，而且难于连 续化生产； 续化生产； 酶反应后成为杂质与产物混在一起， 3．酶反应后成为杂质与产物混在一起，给进一步的分离 纯化带来了一定的困难。 纯化带来了一定的困难。
(a)用双功能试剂交联；(b)共价或非共价偶联于载体上；(c)包埋到载体中。 (a)用双功能试剂交联；(b)共价或非共价偶联于载体上；(c)包埋到载体中。 用双功能试剂交联 共价或非共价偶联于载体上 包埋到载体中
空间障碍；分配和扩散限制；抑制酶的自降解。 空间障碍；分配和扩散限制；抑制酶的自降解。
最适温度：一般变化不大， 2. 最适温度：一般变化不大，但可能固定化方法和固定 化载体会对其有一定影响。 化载体会对其有一定影响。 最适pH值 3. 最适 值： 载体的带电性质 影响因素 酶催化反应的性质
物理吸附法： 3．物理吸附法：利用各种固体吸附剂将酶或细胞吸附在 其表面而使其固定化的方法，又简称为吸附法。 其表面而使其固定化的方法，又简称为吸附法。 常用的吸附剂：活性碳，氧化铝，硅藻土， 常用的吸附剂：活性碳，氧化铝，硅藻土，多孔陶 多孔玻璃，硅胶，羟基磷灰石等。 瓷，多孔玻璃，硅胶，羟基磷灰石等。
酶反应过程能够加以严格控制； 4．酶反应过程能够加以严格控制； 产物溶液中没有酶的残留，简化了提纯工艺； 5．产物溶液中没有酶的残留，简化了提纯工艺； 较游离酶更适合于多酶反应； 6．较游离酶更适合于多酶反应； 可以增加产物的收率，提高产物的质量； 7．可以增加产物的收率，提高产物的质量； 酶的使用效率提高，成本降低。 8．酶的使用效率提高，成本降低。 （二）缺点 固定化时，酶活力有损失； 1．固定化时，酶活力有损失； 增加了生产的成本，工厂初始投资大； 2．增加了生产的成本，工厂初始投资大； 只能用于可溶性底物，而且较适用于小分子底物， 3．只能用于可溶性底物，而且较适用于小分子底物，对 大分子底物不适宜； 大分子底物不适宜；
米氏常数： 6．米氏常数： 载体：扩散限制； 载体：扩散限制； 载体的带电性质： 载体的带电性质：底物分子在扩散层和整个溶液之 间的不均一分布。 间的不均一分布。 电中性载体及与底物电荷相同的载体： 电中性载体及与底物电荷相同的载体： 与底物电荷相反的载体： 与底物电荷相反的载体：
固定化酶的应用举例： 六：固定化酶的应用举例：酶传感器 酶传感器是由固定化酶与传感元件两部分组成的 两部分组成的， 酶传感器是由固定化酶与传感元件两部分组成的，其 固定化酶 中酶是与适当的载体结合形成的不溶于水的固定化酶 膜。 最常用的酶传感器是酶电极， 最常用的酶传感器是酶电极，即将固定化酶膜与转换 酶电极 电极做在一起， 电极做在一起，当酶膜与被测物发生催化反应而生成 电极活性物质后， 电极活性物质后，电极检测活性物质并将其转换为电 信号输出。 信号输出。
不可能 不可能 中 高
五．固定化酶的性质 稳定性： 1. 稳定性： 固定化酶的稳定性一般比游离酶的稳定性好。 固定化酶的稳定性一般比游离酶的稳定性好。主要表 现在：热稳定性提高，保存稳定性好， 现在：热稳定性提高，保存稳定性好，对蛋白酶的抵 抗性增强，对变性剂的耐受性提高。 抗性增强，对变性剂的耐受性提高。
固定化应该有利于生产自动化、连续化。为此， 2．固定化应该有利于生产自动化、连续化。为此，用 于固定化的载体必须有一定的机械强度； 于固定化的载体必须有一定的机械强度； 固定化酶应有最小的空间位阻， 3．固定化酶应有最小的空间位阻，尽可能不妨碍酶 与底物的接近，以提高产品的质量； 与底物的接近，以提高产品的质量；
第一节 酶的固定化 固定化酶( 一．固定化酶(immobilized enzyme)的定义 ) 指固定在一定的载体上并在一定的空间范围内进行催 化反应的酶。 化反应的酶。
水溶性酶 水不溶性载体
固定化技术 水不溶性酶 （固定化酶） 固定化酶）
二．固定化酶的优缺点 （一）优点 极易将固定化酶与底物、产物分开； 1．极易将固定化酶与底物、产物分开； 2．可以在较长时间内进行反复分批反应和装柱连续反 应； 在大多数情况下，能够提高酶的稳定性； 3．在大多数情况下，能够提高酶的稳定性；
酶与载体必须结合牢固， 4．酶与载体必须结合牢固，从而使固定化酶能回收 贮藏，利于反复使用； 贮藏，利于反复使用；
固定化酶应有最大的稳定性，所选载体不与废物、 5．固定化酶应有最大的稳定性，所选载体不与废物、产 物或反应液发生化学反应； 物或反应液发生化学反应； 固定化酶成本要低，以利工业使用。 6．固定化酶成本要低，以利工业使用。 四．酶的固定化方法
a. 载体性质对最适pH的影响： 载体性质对最适 的影响： 的影响 负电荷载体→最适 向碱性一侧移动 向碱性一侧移动； 负电荷载体→最适pH向碱性一侧移动； 正电荷载体→最适 向酸性一侧移动 向酸性一侧移动； 正电荷载体→最适pH向酸性一侧移动； 不带电荷载体→最适pH一般不移动。 一般不移动。 不带电荷载体→最适 一般不移动