几种蛋白原料的体外消化率的测定方法的比较

几种蛋白原料的体外消化率的测定方法的比较

摘要：试验分别采用胃蛋白酶-胰蛋白酶两步法、肉食性鱼类（如鲈鱼）消化道粗酶提取液消化法和草食性鱼类（如草鱼）消化道粗酶提取液消化法测定了酪蛋白、鱼粉、豆粕、菜籽粕、棉籽粕、酵母粉和玉米蛋白粉等7种蛋白质原料的体外消化率。3种测定方法中，鱼粉的消化率差异不显著（P>0.05）；豆粕、菜籽粕、酵母粉和玉米蛋白粉用两步法和草鱼消化酶法测定的消化率无显著差异（P>0.05）；棉籽粕消化率用两步法测定值高于用消化酶法的测定值，差异极显著（P<0.01）；豆粕、菜籽粕、酵母粉和玉米蛋白粉的消化率用两步法比用鲈鱼消化酶测定的值高，差异极显著（P<0.01）；草鱼消化酶法和鲈鱼消化酶法对酪蛋白的消化率无显著差异（P>0.05），而对于豆粕、菜籽粕、棉籽粕、酵母粉和玉米蛋白粉草鱼消化酶法测定值高于鲈鱼消化酶法的测定值，差异极显著（P<0.01）。结果表明，胃蛋白酶-胰蛋白酶两步体外消化法在测定鱼粉蛋白质消化率时可替代鱼类消化液粗酶消化法，对其它蛋白质原料使用该方法应慎重。关键词：蛋白质饲料；体外消化率；测定方法

消化率是动物从食物中所消化吸收的部分占总摄入量的百分比，是评价饲料营养价值的重要指标之一。测定饲料消化率主要有两种方法：体外法和体内法。体内法测定的消化率能够比较真实的反映鱼类对饲料的消化情况。但体内法测定方法复杂、时间长、费用高，而且对外界环境的要求较高，季节、温度、光照等都会影响消化率测定值。体外消化法是利用精制的消化酶或研究对象的消化道酶提取液在试管内进行的消化试验，其测定值可近似反映鱼对饲料的消化率。此法能快速测定原料的相对利用率，为营养师制作配方提供参考[1]。然而，体外消化法无法反映体内消化的真实情况。Boisen和Eggum（1991）在胃蛋白酶-胰蛋白酶两步法中利用标准过滤装置测得饲料蛋白质消化率与鼠和猪的真消化率十分接近，他们认为这种方法测得的蛋白质体外消化率经内源氮校正与回肠末端蛋白质表观消化率高度相关。我国饲料原料品种多，营养成分含量差异大，加工方式各异，饲料原料对不同鱼类的营养价值差异更大。由于鱼类生活在水中，测定鱼类饲料真消化率比测定畜禽的更加困难。所以寻找一种准确、简便、实用的消化率测定方法对评价鱼类饲料的消化率有着十分重要的意义。本试验采用胃蛋白酶-胰蛋白酶两步体外消化法以及从肉食性和草食性鱼类的消化道提取消化酶在体外消化饲料的方法，测定了7种常用蛋白质饲料原料的消化率，为饲料生产者配制鱼用饲料提供基础数据，同时为体外测定鱼用蛋白质原料消化率提供参照。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 饲料原料

酪蛋白、鱼粉、豆粕、菜籽粕、棉籽粕、酵母粉和玉米蛋白粉，均为经105℃烘干处理的样品，粉碎过60目筛后保存备用。

1.1.2 主要试剂

硫酸（GB 625—77）、硫酸铜（GB 665—78）、硫酸钾（HG 3—920—76）和氢氧化钠（GB 629—77），均为分析纯。

硼酸（GB 628-78）（分析纯）：2g溶于100ml水配成2%溶液（W/V）。

混合指示剂：甲基红（HG 3—958—76）0.1%乙醇溶液，溴甲酚绿（HG 3—1220—79）0.5%乙醇溶液，两溶液等体积混合，阴凉处保存期三个月以内。

0.05mol/l HCl溶液：取4.2ml浓盐酸，用蒸馏水定容至1L。

标定甲基红-溴甲酚绿混合指示剂：取20 ml 0.1%甲基红酒精溶液，与20ml 0.5%溴甲酚绿酒精溶液，混匀。

胃蛋白酶活性为1：10 000；胰蛋白复合酶活性为2 500IU/mg；鲈鱼消化道混合液；草鱼消化道混合液；双抗为青霉素G钾盐（150 IU/ml）和硫酸链霉素（150IU/ml）；14%磺基水杨酸钠。

1.1.3 主要仪器

实验用样品粉碎机、分析筛（孔径0.60mm）、分析天平（感量0.001g）、滴定管（酸式，100ml）、电炉、消化炉、电热式恒温烘箱、干燥器、凯氏蒸馏装置、过滤装置、磁力搅拌器、离心机、恒温水浴振荡器等。

1.2 试验方法

1.2.1 原料蛋白质测定

1.2.1.1 消化

称取0.6～0.7g（准确至0.001g）试样，无损失地放入消化瓶中，加入无水硫酸钠和硫酸铜的混合物[m（CuSO4·5H2O)：m(Na2SO4)=1：9]6g，与试样混合均匀，再加浓硫酸20ml，在消化炉上小心加热，起初电压调大，冒烟时调小电压，大量冒烟后再调大电压，加热至样品呈透明的浅蓝色或白色为止，关上电源，使消化瓶自然冷却。而后，用蒸馏水冲洗消化瓶，洗液注入100ml容量瓶内，定容。同时做一个空白对照试验。

1.2.1.2 蒸馏

连接好凯氏蒸馏装置，加热使之产生蒸汽。取20%硼酸溶液20ml置于150ml三角瓶内，并加混合指示剂1滴，然后将其置于冷凝管下。吸取消化稀释液10ml，由漏斗处加入反应室内，再加40% NaOH溶液10ml。使蒸汽进入反应室，加热蒸馏，直至三角瓶内硼酸溶液增加1倍体积，移开三角瓶，停止加热。将空白对照的消化液做同样处理。

1.2.1.3 滴定

用0.05 mol/l盐酸标准溶液滴定，到接收液由绿色变为灰红色即是终点。同样滴定空白实验的接收液。

1.2.1.4 计算

式中：CB——含氮量；NHCl——滴定所用盐酸的浓度；V1——试样滴定时所需酸标准溶液的体积（ml）；V2——空白滴定时所需酸标准溶液的体积（ml）；m——试样的质量（g）。

1.2.2 消化液测定法

1.2.2.1 胃蛋白酶最适量的选择

分别取0.5g豆粕置于3个三角瓶中，各加入含不同胃蛋白酶活性单位（100IU、160IU、200IU）的pH值为1.4的0.05mol/l HCl-KCl缓冲液30ml，在40℃台式恒温摇床上保温3h后过滤，多次冲洗残留物，用凯氏定氮法测定残留物的蛋白质含量。计算饲料蛋白质消化率，确定出胃蛋白酶的最适用量为160 IU（表1）。

1.2.2.2 胰蛋白酶最适用量的选择

分别取0.5g豆粕置于3个三角瓶中，用含有胃蛋白酶浓度为0.05mol/l的HCl-KCl 缓冲液做前处理，之后加0.2mol/l的氢氧化钠溶液处理消化液使之pH值等于6.8。再分别加入含不同胰蛋白酶活性（100IU、150IU、200IU）的0.05mol/l的

KH2PO4-NaOH缓冲液。继续培养3h，测定饲料的蛋白质消化率，确定出胰蛋白酶的最适用量为150IU（表2

1.2.2.3 离体消化程序

①胃蛋白酶处理

a.称取0.5g饲料样品2份，分别置于250 ml带盖三角瓶中（每个样品测2个平行样）。

b.准确称取1.777g胃蛋白酶（准确到0.001g），置于体积100ml、pH值1.4的HCl-KCl缓冲液中。

c.用移液管移取30ml上述混合液置于三角瓶中。