猪萎缩性鼻炎产毒多杀性巴氏杆菌的研究进展

1猪萎缩性鼻炎产毒多杀性巴氏杆菌的研究进展
刘建杰吴斌陈焕春
(华中农业大学牧医学院动物病毒室武汉430070)
摘要产毒多杀性巴氏杆菌是引起猪进行性萎缩性鼻炎的一种重要的病原菌，对该菌的检出是根除净化此病的关键。

本文对产毒多杀性巴氏杆菌的致病机理、检测方法及其发展进行了综述，并初步探讨了猪萎缩性鼻炎疫苗的发展方向。

关键词产毒多杀性巴氏杆菌致病机理检测方法疫苗
萎缩性鼻炎是猪的一种呼吸道传染性疾病，临床上以出现化脓性鼻腔分泌物、鼻子变短或扭曲、鼻甲骨萎缩和生长性能下降为特征，给养殖业带来严重的经济损失[1]。

此病病因复杂，环境因素和病原因子在该病的发生中均起一定的作用。

现已确认其主要病原为支气管败血性波氏杆菌（Bb）和多杀性巴氏杆菌产毒素菌株（DNT+Pm）。

其中DNT+Pm和严重的进行性萎缩性鼻炎密切相关[2]，该病一经发生，或大或小地对养殖场的经济效益都有影响，从而成为制约生产效率的瓶颈。

对该菌的快速检出，淘汰阳性带菌猪，建立健康猪群是根除净化此病的关键。

1．产毒多杀性巴氏杆菌的致病机理
Gwatkin等（1953）提出多杀性巴氏杆菌(Pm)与该病有联系，随后产毒素菌株的发现证实了该菌在萎缩性鼻炎中的重要作用（Il`ina等，1975；De Jong 等，1980）。

产毒素菌株可引起严重进行性萎缩性鼻炎和不可逆转的鼻甲骨损伤（Rutter 等,1982; Rutter 1983）。

它们在鼻腔中的定居能力依赖于鼻腔的预处理，包括：猪支气管败血性波氏杆菌的预感染（Rutter 等,1982），用稀醋酸对鼻腔的预处理（Pedersen 等，1984）或其它物理性的鼻粘膜损伤。

通过鼻腔接种Pm毒素粗提物引起鼻甲骨损伤（Il`ina等，1975）或鼻腔接种少量提纯毒素就可复制出本病（Dominic等，1986），从而知道该毒素是DNT+Pm 的主要致病因子。

通过鼻腔接种毒素复制出该病及病理学的研究，人们初步知道毒素主要通过抑制鼻甲骨中心骨细胞的合成和增强骨的吸收作用而导致鼻甲骨的萎缩[3]。

最近，人们关于毒素对DNT+Pm在鼻腔中的定居和细胞变化的作用加深了了解。

具体作用为毒素一方面使破骨细胞数量增多，功能增强而使骨的吸收能力增强；另一方面则使成骨细胞的前体细胞生长加快而不能再分裂，已成熟的成骨细胞进行性变性而又得不到补充，从而骨的合成能力下降，致使鼻甲骨生长过程中的合成与吸收作用失去平衡而萎缩消失[4]。

人们还发现这种作用只针对鼻甲骨，其它部位的骨结构则没有变化，其机理还不清楚。

目前有两种假说：1、鼻甲骨有该毒素的特异性受体；2、毒素只对生长快的骨起作用，而猪的鼻甲骨属于生长快的骨。

另一项研究表明，毒素的这种作用对长骨可
1作者简介：刘建杰（1975~），男，河南濮阳人，硕士研究生，主要从事猪痢疾和萎缩性鼻炎方面的研究工作
能也有作用[4],但有待于进一步的证实。

有证据表明，毒素可在10~14天内使鼻甲骨完全萎缩，而且其作用可以持续。

更加深入的致病机理正在研究之中。

2．产毒多杀性巴氏杆菌毒素及检测
借助于分子生物学的手段，人们进行了毒素基因的克隆与表达。

研究得知，毒素为单纯的蛋白质，分子量为143kD,是一种不耐热的蛋白质，加热70℃30分钟，甲醛或戊二醛、胰酶处理均可使其失去毒素活性。

该毒素还是一种高效的生长因子（Rozengurt等，1990），是迄今为止发现的效力最强的生长因子，独自就可引起细胞生长和分裂。

毒素可引起豚鼠皮肤坏死和小鼠致死或脾脏萎缩，这些动物实验可用来区分鉴定产毒素和不产毒素Pm。

后来发现胎牛肺细胞（EBL）培养物对这一毒素特别敏感，所以人们用此细胞形状的改变来检测毒素的产生。

此外，非洲绿猴肾细胞（Vero）也可用来检测该毒素（Pennings 等，1984），但其敏感性稍低。

利用毒素能侵害EBL的特性，随后发展了一种快速检测DNT+Pm的方法[5]。

用棉拭子取样，低温运送到实验室，接种于Pm选择性培养基。

然后将Pm 菌样菌落再接种于琼脂覆盖的EBL细胞板上。

经过一段时间的培养，DNT+Pm 就会产生足量的毒素，通过琼脂层扩散作用于细胞引起形状的改变，从而区分产毒和不产毒菌株，在取得样品后48h就可得出结果。

但因获得此细胞培养材料困难，此实验不能广泛使用。

之后人们发展了另一种检测毒素的方法，单抗夹心ELISA法，利用两种和Pm毒素有特异亲和力的鼠源单克隆抗体来检测分离细菌所产生的毒素[6]。

目前ELISA检测方法已经标准化、商品化，在一些国家广泛用于区分带菌猪及预防传播。

但以上毒素检测方法，无论是动物实验还是细胞培养，操作繁琐，费时费力，临床上的应用都有很大的局限性。

随着DNT+Pm毒素基因的分子生物学研究，该病的快速诊断技术变为现实，从而使该病的快速检出及根除成为可能。

3．产毒多杀性巴氏杆菌毒素基因及其检测
Petersen等（1989）[7]进行了Pm的毒素基因（toxA）的克隆和表达，所得产物经比较和天然毒素性质基本一样，并观察到毒素基因只存在于产毒菌株中，为以后的PCR检测方法提供了理论依据。

Lax等（1990）[8]也进行了Pm 毒素基因的克隆和表达，得到的结果和以上实验基本一样，同时也注意到毒素基因只存在于产毒菌株中，表达的毒素同样能引起萎缩性鼻炎并可侵害实验室细胞培养。

这进一步证实了毒素在该病中的作用，为检测毒素区分Pm的实验提供了理论依据。

Kamps 等（1990）则进行了研制基因探针的工作。

把分离的细菌在薄膜上提取DNA并利用基因探针同毒素基因进行反应。

检测可通过放射法进行或通过酶将无色的可溶物转变为有色的不可溶物质并且只沉积在同产毒菌DNA 结合的地方。

基因探针检测DNT+Pm的特异性和灵敏度大为提高。

1990年有两个实验室对两株来源不同的DNT+Pm的毒素基因进行了全序列的测定，从而为DNT+Pm的分子生物学诊断奠定了基础。

毒素基因命名为
toxA，编码1285个氨基酸残基，不同来源的DNT+Pm毒素基因和编码蛋白基本相同。

1991年，Magyar等用过氧化物标记的单克隆抗体在尼龙膜上进行菌落原位杂交检测初级培养物的Pm样菌落，其准确性和特异性也很好，在临床样品检测上的应用价值有待进一步探索。

Nagai等[9]首次报道应用PCR的方法来检测区分产毒和不产毒的Pm，其引物是根据toxA基因序列设计的，扩增毒素基因（toxA）中的特定片段，发现只有DNT+Pm才能扩增出预定的片段，不产毒的Pm则没有此片段，而且A、D 型DNT+Pm扩增产物相同，这就提示我们用PCR方法或许可以同时检测A、D 型DNT+Pm，这就为该病的根除提供了技术保障。

Kamp等（1996）[10]探索出一种适合于大规模普查检测扁桃体拭子和鼻拭子中DNT+Pm的敏感高效的PCR方法。

它利用两对引物来扩增toxA中的两个特定片段，特异性大大提高。

已有用此法来检测或根除猪萎缩性鼻炎的报道[11,12]。

Lichtensteiger等（1996）[13]发展了一种更为快速、准确地检测DNT+Pm的方法－Direct PCR。

该方法不需要培养单个菌落，可直接检测鼻拭子中少于100个的细菌。

实验检测的40个分离株，其结果与菌落原位杂交、菌落免疫印迹分析法、细菌超声波裂解物致死小白鼠试验完全符合。

该法比Kamp等（1996）的方法简单易行，更适合小量的研究及检测，尽管它有产生假阳性的可能[14]。

Amigot等[15]对检测DNT+Pm的三种方法做了对比：胎猫肺细胞系（FLF）培养物、ELISA试剂盒、PCR方法。

结果发现在PCR扩增物电泳带非常明显时，三者的结果基本完全一致。

而有两个样品，PCR产物电泳带较弱，前两者却均呈阴性结果，重复实验结果一样，这有几种可能：PCR方法的敏感性较前两者要高；错误的扩增；样品中污染了DNT+ Pm。

而根据最近的一项研究，由于Pm性质多变，PCR的方法对单个的Pm或许会有错误的结果，要结合动物实验和细胞培养等多种方法才能得出正确的结果。

所以用PCR的方法检测临床样品，需要做进一步的工作来消除反应中的非特异性反应。

4．产毒多杀性巴氏杆菌的毒素与免疫
用甲醛将毒素灭活，使其不能引起猪萎缩性鼻炎，不过将灭活的毒素注入猪体内就可刺激猪产生抗体。

抗体可用各种实验室测试法检测出，如检测其能否中和或防止提纯的毒素对细胞培养的作用。

抗体的这一能力，再加上已知可用提纯的毒素引发萎缩性鼻炎的所有症状，这就提示我们，毒素的抗体（抗毒素）也许可保护感染了DNT+ Pm的猪。

曾有人给猪注射灭活的提纯毒素，灭活的完整产毒菌或是灭活产毒菌的粗提物，以图产生抗毒素（Chanter 等，1990）。

结果只有注射了提纯的类毒素（灭活的毒素）的猪产生了抗毒素，而其他的猪产生了大量抗菌体其他组分的抗体。

然后将这些抗血清注射给另一些猪，随后再用DNT+ Pm感染这些猪。

结果只有注射了抗毒素的猪得到了保护。

Bording等（1991）[16]在小鼠模型中证实福尔马林灭活的纯化类毒素才具有刺激机体产生抗毒素的能力，而且这种能力不受加入Bb或不产毒Pm 和百日咳杆菌的影响，粗提的类毒素则不能激起机体产生对毒素的保护力或
产生的免疫力较弱。

Thurston等（1991）[17]用纯化的类毒素免疫小鼠也能防止小鼠的死亡或其它毒素引起的不良反应（如肝坏死，白细胞增多，补体效价升高等）。

这些结果都证实了毒素在萎缩性鼻炎中的作用，并且证明了可用抗毒素来保护感染猪。

这些结果还表明了，如果要用毒素作为疫苗，就必须对毒素作一定程度的提纯以提高疫苗刺激机体产生抗毒素的能力。

如今已有愈来愈多的用纯类毒素制作的商品疫苗可用来产生对猪的保护性抗体，而且效果也很好。

5．萎缩性鼻炎疫苗的发展方向
最初的疫苗为Bb单苗，随着人们对该病认识的加深，制成了加有Pm或和其类毒素的联苗。

但是还有一个问题，免疫注射用的毒素可用化学方法灭活，但这种灭活并不总有效，毒素的灭活不够就可产生严重的后果，所以还必须作大量的工作以保证疫苗的安全性。

通过分子生物学的方法，对毒素基因进行操作，如从毒素基因中切下一小段，使表达产生的毒素丧失活性，但其仍可刺激机体产生能保护猪的抗毒素[18，19]。

Bording等（1994）[20]报道了一种只包含Pm毒素的无毒重组衍生物的萎缩性鼻炎单苗，和另一种疫苗组及对照组相比，其保护效果明显：屠宰时鼻甲骨萎缩轻微，血清学检测表明毒素保护抗体高，而且猪的生长性能良好，显示了很好的应用前景。

但有实验发现,没有Bb的D型Pm类毒素单苗保护效果欠佳[21]。

随后的研究表明，类毒素单苗的保护效果在以DNT+Pm感染为主的猪群保护效果较好。

经过实验证实，Bb菌苗中加有D型Pm提纯类毒素的联苗效果最好，而且该苗对A型DNT+Pm的攻击也同样具有保护作用[22]。

通过对Pm toxA基因表达的研究发现，该基因的表达相当保守，而且表达毒素的产量要比天然毒素高10倍左右[14]。

这样经过重组表达的毒素产量高，不用灭活，更适合生产的需要。

如果技术成熟的话，就可大量生产应用，这可能也是萎缩性鼻炎新型疫苗的发展方向。

虽然目前毒素的灭活度还没有统一的检测标准，但疫苗厂和使用者对这种基因工程苗的安全性却可完全放心。

参考文献（略）。