番茄灰霉病菌颉颃菌的筛选

番茄灰霉病菌颉颃菌的筛选

摘要:对从不同生态环境下采集的样品进行分离纯化,共得到菌株68株｡经初筛,得到对番茄灰霉有颉颃作用的生防菌株16株,占分离菌株的23.5%｡并对其中较强颉颃作用的9株菌株进行抑菌活性的测定｡结果表明:滤纸片法得到的各菌株对番茄灰霉的抑制率在65.1%~92.0%之间,抑菌带在2.0~11.0 mm之间,共获得颉颃菌株8株,占分离菌株的11.8%｡

关键词:番茄灰霉;颉颃菌;筛选;生物防治

Screening of Antagonistic Strain Against Botrytis cinerea

Abstract:68 strains were collected from different environments around Xingtai University and purified. 16 strains having antagonistics effect to Botrytis cinerea, which account for 23.5% in total were obtained. Among them, 9 strains having great intensive repression to Botrytis cinerea were detected. According to filter-paper detection, the suppression ratio of varieties maintained ranged from 65.1% to 92.0%; and bacteria-resistance region ranged from 2.0 to 11.0 mm. In addition, 8 anti-bacteria strains were obtained for biological control.

Key words: Botrytis cinerea; anti-bacteria; separation; bio-control

番茄灰霉病是由番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)引起的一种真菌病害,危害番茄的茎､叶､花及果实,以危害幼果为主,损失率一般在25%~30%,重者可造成绝产｡近年来,随着日光温室､塑料大棚､地膜覆盖等保护措施的改进,番茄种植面积不断扩大,加之茬次增多,为番茄灰霉病的滋生蔓延创造了条件｡番茄灰霉病是一种世界性重要病害,目前化学防治是常用手段,由于频繁施用杀菌剂,病菌抗药性严重｡并且施药时以果实为主要目标,造成了一定的农药污染｡在病害防治措施中,抗性品种的应用是最为经济有效的方法,但灰霉病抗源的匮乏,限制了抗性品种的选育[1]｡因此,近年来利用有益微生物来防治灰霉病已成为新的防治策略｡迄今为止,已有近百种微生物农药来自于微生物的次生代谢物,其中有多抗霉素､农抗120､武夷菌素､新生霉素､中生菌素等环境友好型生物农药｡国外报道多种真菌､细菌对灰霉病菌均有一定的抑制作用,如木霉､粘帚霉､酵母菌､假单胞杆菌等[2]｡在国内,从污水和土壤采样筛选番茄灰霉菌颉颃菌的报道较多,但从植物体采样进行筛选的甚少[3,4]｡本试验从不同生态环境下采样,筛选对番茄灰霉病菌有颉颃作用的菌株,并测定其抑菌效果,为充分挖掘有益微生物资源,利用生防菌防治番茄灰霉病提供理论依据,同时也为研究抑菌活性物质及其抗菌作用机理打下基础｡

1材料与方法

1.1材料

1.1.1样品分别从邢台学院西边小花园杨树下采集土样,从邢台学院内牛尾河采集水样,从邢台学院西边小花园柳树的不同部位取样(根部､树干､枝条),贴上标签,记下采样时间､地点､环境情况,带回实验室｡

1.1.2供试病原微生物从邢台市北郊外新星村一农户蔬菜大棚内采集分离得到｡

1.1.3主要仪器恒温光照培养箱,电热鼓风干燥箱,高压蒸汽灭菌锅,电热炉,超净工作台等｡

1.2方法

1.2.1微生物的分离､纯化采用参考文献[5]中的方法对土壤､污水和植物体中的微生物进行分离纯化｡

1.2.2对番茄灰霉颉颃菌的筛选将番茄灰霉病菌菌株接种在PDA平板上培养5 d,然后用打孔器打取菌龄一致的菌片,转接到另一PDA平板中央,在菌片的正上､下方2 cm处各划线接种同一种分离的菌株,每处理3次重复,放于25℃恒温培养｡待菌落将长满培养皿时,观察并记录每种菌株对番茄灰霉病菌生长抑制作用的强与弱,筛选出对番茄灰霉病菌有较强颉颃作用的菌株｡

1.2.3番茄灰霉病菌颉颃菌抑菌活性的测定将筛选到的具颉颃作用的菌株分别制成109个/mL菌悬液｡用打孔器打取番茄灰霉病菌菌龄一致的菌片,转接到另一PDA平板中央,在菌片的正上､下方2 cm处,接入沾有待测菌株相同浓度菌悬液的滤纸片2片,各个稀释度重复3次,以接沾有无菌水滤纸片的平板作对照,放于25℃恒温培养｡待对照菌落将长满培养皿时,测量菌落生长量和待测菌菌落边缘至灰霉病菌菌落边缘的间距(抑菌带)确定抑菌程度,计算抑制率｡以抑菌带大于 1 mm 的菌株记为有颉颃作用的菌株;抑菌带大于5 mm的菌株作为颉颃菌株[4]｡抑制率(%)=(对照菌落生长量-处理菌落生长量)/对照菌落生长量×100｡

2结果与分析

2.1微生物分离､纯化结果

对不同生态环境下采集的菌样,通过梯度稀释法,用3种不同培养基进行分离,经过纯化后共分离到菌株68株｡

2.2番茄灰霉病菌颉颃菌筛选结果

采用室内对峙培养法对分离得到68株菌株进行了颉颃性的测定｡结果表明:有些菌株与番茄灰霉病菌互不干扰;有些菌株表现出抑制作用,但不存在抑菌带;有些菌株表现出颉颃作用,即抑菌带明显,少部分菌株表现出较大的抑菌带｡其中具有颉颃作用的菌株16株,占分离菌株的23.5%(见表1);表现较强颉颃作用的菌株9株,占分离菌株的13.2%,有ZG-2､SP-2､TN-5､SP-1､TP-5､TG-4､SG-1､ZN-4､ZP-4｡

2.3番茄灰霉病菌颉颃菌抑菌活性的测定结果

采用滤纸片法,对番茄灰霉病菌具颉颃作用的菌株进行了抑菌活性的测定,结果见表2｡由表2可以看出:各菌株对番茄灰霉病菌的抑制率在65.1%~92.0%之间,抑菌带在2.0~11.0mm之间｡其中ZN-4的抑菌效果最佳,抑制率达92.0%,抑菌带达11.0 mm;SP-2､TP-5､TN-5､TG-4､SG-1､ZG-2､SP-1的抑菌带均达5 mm以上,即获得颉颃菌株8株,占分离菌株的11.8%｡

3讨论

土壤､污水､植物体中的微生物由于其特殊的生存环境,会产生不同的活性物质｡随着生物防治的深入发展,微生物资源的开发利用将会受到世界各国的重视和青睐｡本试验从土壤､污水､植物中共分离到了68株菌株,并在室内测试了它们对番茄灰霉病菌的抑制作用,筛选得到16株具有颉颃作用的菌株｡采用滤纸片法对其中表现较强颉颃作用的9株进行了抑菌活性测定,得到8种颉颃菌株｡值得一提的是,ZN-4是从植物体柳树上采集的菌样,表现出最强的抑菌活性,从而可知,植物体可作为筛选颉颃菌种的良好材料资源｡试验中还发现,SP-2在抑菌活性测定后再培养期间,其抑菌带有较大的外延现象,可能在于它的防治效果依赖于一定量的代谢产物的积累,也可能其抑菌活性物质产生较晚,还有待于进一步研究｡试验充分表明了土壤､污水､植物体中微生物作为新的农用抗生素资源的可能性,在农业病害防治上有一定的潜在价值,也为开发新型生物农药奠定了基础｡但颉颃菌菌种鉴定及其生物特性､颉颃物质的产生条件,颉颃物质的理化性质､酸碱稳定性､热稳定性等均需进一步研究测试｡

参考文献:

[1] 陈双臣,刘爱荣,邹志荣. 转葡聚糖酶和防御素基因对提高番茄灰霉病抗性的研究[J].植物保护学报,2006,33(4):357-362.

[2] 朱宏建,易图永,周鑫钰.土壤放线菌生防活性物质的研究进展[J].作物研究,2007,21(2):149-151.

[3] 赵蕾,杨合同. 蔬菜灰霉病生防菌的筛选与防效试验初报[J].应用与环境生物学报,1999,5(1):85-88.

[4] 唐蕊. 污水中西葫芦灰霉病拮抗细菌的分离与应用[J].北方园艺,2007(9):43-44.

[5] 黄秀梨. 微生物学实验指导[M].北京:高等教育出版社,2004.1-8.