免疫实验(中国医科大学临床药学)

实验安排
实验一、ELISA板包被，封闭；小鼠抗原免疫；补体结合实验
实验二、小鼠脾细胞提取及计数
实验三、流式（测小鼠血T细胞）；NO测定；双扩；血型鉴定
实验四：ELISA；妊娠反应（试纸法）
实验一：ELISA板包被，封闭—小鼠抗原免疫—眼球取血（一）包被、封闭ELISA反应板
1.实验步骤：
a.微量加样器的使用
b.包被ELISA 反应板，37℃孵育1小时。

c.封闭ELISA反应板，37℃孵育0.5小时。

2.实验目的：检测小鼠抗绵羊红细胞抗体水平
3.试剂与器材：
a.包被稀释液（0.05mol/L Na2CO3—NaHCO3 缓冲液，pH9.6）
Na2CO3 1.5g；NaHCO3 2.9g 加双蒸水至1000ml
b.封闭液（5%小牛血清/PBS 溶液）
小牛血清50ml；PBS（pH7.4）950ml
c.洗涤液（PBST，pH7.4）
NaCl 8.0g；KH2PO4 0.2g；Na2HPO4.12H2O 2.9g；KCl 0.2g；Tween 20 0.5ml 加双蒸水至1000ml
4.操作方法：
包被酶标反应板：
a.待测血清：绵羊红细胞（SRBC）免疫小鼠血清
b.用pH9.6 的碳酸盐缓冲液1：200 稀释的抗原SRBC，用之包被聚乙烯塑料板。

c.每孔加100ul，37℃温箱孵育1小时
封闭酶标反应板
d.弃掉包被液，加入200ul PBS洗涤3 次，每孔洗3遍，每遍1min。

e.甩干后用5%小牛血清/PBS 液封闭，每孔200ul。

放37℃0.5小时。

f.封闭结束后，弃掉封闭液，加入200ul PBS洗板3次，并在滤纸上拍干，每孔洗3遍，
每遍1min。

步骤说明：
1.酶联免疫吸附试验技术（Enzyme-linked Immunosorbent Assay，ELISA）（定量、定性实
验）：是在免疫酶技术(immunoenzymatic techniques)的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术,ELISA过程包括抗原(抗体)吸附在固相载体上称为【包被】，加待测抗体(抗原), 再加相应酶标记抗体(抗原),生成【抗原(抗体)--待测抗体(抗原)--酶标记抗体】的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物。

借助分光光度计的光吸收计算抗体(抗原)的量。

待测抗体(抗原)的定量与有色产生成正比。

2.【包被】：就是将已知抗原或抗体吸附于固相载体表面并保持其免疫原性。

在ELISA 板
上加上抗原以后，因为电荷数与板不同，所以抗原吸附板上，但是吸附后固相载体表面尚有未被占据的空隙；
3.【封闭】：就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而防止在ELISA其后的步骤中
干扰物质的再吸附
原理：
4.抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面,可能是蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性
部分相互吸附,并保持其免疫学活性;
5.抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物,而此种酶结合物仍能保持其免疫学和
酶学活性;
6.酶结合物与相应抗原或抗体结合后,可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应
的存在,而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的,因此,可以按底物显色的程度显示试验结果.
注意事项：
1.量取样品时选择适当量程的加样器，（P20：0.5～20.0 µl；P200：20～200 µl；P1000：
200～1000 µl）
2.安装相应的枪头（白色P20，黄色P200，蓝色P1000）
（二）小鼠腹腔免疫
1.实验动物：昆明鼠6-8周，雌性
2.实验药品：抗原：绵羊红细胞（SRBC）
3.腹腔注射：5%的SRBC注射2ml
4.操作步骤：
免疫细胞的制备：
准备适量的全血细胞：SRBC
1500rpm*10min
小心吸弃上清，留红细胞沉淀
3mL生理盐水，重悬细胞沉淀
重复上述步骤，反复洗3次。

第三次离心后：
3mL生理盐水，重悬细胞沉淀：制备好的SRBC.
腹腔注射：
左手提起并固定小鼠，使鼠腹部朝上，鼠头略低于尾部。

右手持注射器将针头在下腹部靠近腹白线的两侧进行穿刺，针头刺入皮肤后进针3mm 左右。

使注射针头与皮肤呈45°角刺入腹肌，穿过腹肌进入腹膜腔，当针尖穿过腹肌进入腹膜腔后阻力消失，有落空感。

固定针头，保持针尖不动，回抽针栓，如无回血、肠液或尿液后即可注射。

注射量为2ml，标记小鼠。

5.注意事项：免疫之前排空注射器中的空气；
SRBC使用之前要混匀；.
进针后的落空感。

（三）小鼠眼球取血
1.实验目的：小鼠腹腔抗原（SRBC）免疫后，小鼠体内产生了抗体，抗体（抗SRBC抗
体）主要存在于血清内。

眼球取血主要目的为收集血清。

2.实验药品：麻醉用药：4%水合氯醛；
3.实验步骤：
a.小鼠麻醉—麻醉用药：4%水合氯醛；用量：每只小鼠0.4ml，腹腔注射
b.眼球取血：
1、抓取小鼠，使眼球突出
2、用眼科【弯镊】深入眼球深部，带着结缔组织，慢速夹去眼球，用1.5ml微量离心
管接住流出的血液，每次采血量0.5-1ml
3、实验台上静置2h（11点左右）
4、离心10000rpm，10min，收集血清，-20℃保存
c.把取完眼球血的小鼠泡在装有70%酒精的烧杯中，接续【实验三】
d.将眼球血离心10000rpm，10-15min，
e.使用1000μL加样器收集血清
（四）
实验二：补体结合试验
1.实验试剂：2% sRBC；溶血素（血清中含有家兔-抗-sRBC 抗体）；补体（新鲜的豚鼠
血清）；生理盐水
2.实验器材：小试管、微量加样器、水浴箱
3.实验步骤：
a.标记3个清洁、干燥的试管
b.加样（加样顺序如图）
c.水浴，37℃，孵育10m
4.注意事项：
a.挑选干燥、洁净是试管。

若有水的试管会导致红细胞不等渗溶血。

b.水浴箱不可关闭水浴箱的盖子。

水浴箱的盖子上的水若调入试管中，会造成反应体系不
等渗，进而导致红细胞因为渗透压的差异而破裂溶血。

5.实验结果：1号管中试剂变澄清，2.3号试管均浑浊
实验三：小鼠脾细胞提取及计数
1.实验原理：脾脏是人类最大的免疫器官，捕获血源性抗原，储存血液。

是动物体内最大
的淋巴器官。

深居于左侧肋弓之后，颜色暗红、质地柔软、呈内侧向内凹陷的扁椭圆形或条索状等。

脾为表面有被膜覆盖的实体性器官。

脾细胞主要成分：淋巴细胞，是执行免疫功能的重要细胞。

为进一步了解和检测淋巴细胞的数量和功能，还需要制备脾细胞悬液。

2.实验试剂与器材：SRBC免疫一周的小鼠（眼球取血后的死亡小鼠）；
PBS液—作用是等渗、平衡渗透压、维持离子强度和PH；
70%酒精—作用是消毒
红细胞裂解液—2ml冷NH4Cl
动物解剖器械—平镊和齿镊、5ml注射器、平皿、1.5ml微量离心管、15ml离心管、吸管、盖玻片。

离心机，细胞计数板，显微镜
3.实验步骤：
a.取脾：将眼球取血后的小鼠颈椎脱位法处死；
70%酒精皮毛全部浸湿3-5分钟，右侧卧位；
左手持镊（尖头）提起皮肤，右手持剪刀于左侧肋骨最低点与髋关节间做一小切口；
双手持镊子与切口垂直方向钝性分离皮肤，暴露腹膜；
左手持镊提起腹膜右手持剪刀于腹膜做一小切口，双手持镊子与切口垂直方向钝性分离腹膜，充分暴露视野，于左侧肋缘下可见暗红色条索状脾脏；
持【平镊】轻轻夹住脾脏，尽可能分离结缔组织和系膜（注意防止脾脏破裂）；
将取下的脾脏放入装有5mlPBS液的平皿中。

b.脾细胞提取：
方法冲洗法研磨法
省时，便于大量操作
优点制备的细胞数比较少，细胞比较分散；能够保持细
胞的完整性，细胞不易破损
缺点不能保证细胞的完整性
平镊轻轻夹住脾，用5毫升注射器吸取5mlPBS液，刺入脾脏冲洗脾细胞；
拔掉针头用注射器吸取平皿中PBS液反复冲洗2-4次，直至脾脏由暗红色变为白色；
把所获得的细胞悬液收集到15毫升离心管内，加PBS液至10ml（方便离心时配平）；
c.三次离心
目的操作
获得脾细胞收集离心管配平，1500rpm离心10min。

去上清（沉淀贴壁面朝上倾倒上清）
裂解红细胞使用吸管（每吸一次大约1ml）吸取2ml冷NH4Cl裂解RBC。

【混匀】细胞后放置约5min。

加PBS液至10ml；1500r/min再离心5min，去上清
洗涤细胞加PBS液5ml洗涤（上下吹打），1500r/min离心10min去上清。

悬浮细胞于1ml的PBS液中【混匀】。

d.弃上清，向离心管中加入1ml PBS液，充分混匀，得混匀液
e.计数液100倍稀释：先在EP管里加入990微升PBS液，从混匀液中吸取10微升
加入到1.5ml微量离心管中涮一下枪头，反复抽吸几次，充分混匀。

f.显微镜计数：10×物镜找到细胞层和计数室；40×物镜找到白细胞计数区域。

原则
是从左到右S形计数，数上不数下，数左不数右
实验四：抗原抗体反应
1.实验原理：
a.概念：体内外发生的高度特异性结合反应，其结构基础为抗原表位与抗体超变区抗原结
合位点的结构互补。

b.特点：特异性；非共价键结合；比例要适当
c.影响抗原-抗体反应的因素：
电解质：0.85%氯化钠溶液；
温度：37℃；
酸碱度：pH6-8。

抗原抗体复合物可在一定条件下解离，而免疫学特性不变。

d.凝集反应：在颗粒性抗原或吸附于颗粒上的可溶性抗原（或抗体）中加入相应的抗体（或
抗原），在电解质存在的条件下出现凝集物的现象，称凝集反应。

参与反应的抗原如细菌，细胞等，称凝集原，抗体称为凝集素。

包括直接凝集反应（玻片反应、试管反应）和间接凝集反应。

本次实验为玻片反应。

e.凝集反应分类：直接凝集反应：试管法和玻片法（反应界面）
间接凝集反应
间接凝集抑制试验
协同凝集反应
抗球蛋白试验
玻片法简便，快速，为定性试验，可做为半定量检测前的筛查试验，因该反应在玻片上进行而被命名玻片法，主要用于临床的血型鉴定，菌种鉴定
2.实验器材：人外周血；抗A、抗B标准血清；（蓝色的为抗A，黄色的为抗B）；玻片（两
种），采血针，棉签，酒精等
3.实验步骤：
a.准备玻片：取清洁载物玻片一张，于玻片左侧和右侧各加一滴抗A及抗B标准血清
b.采血：用无菌采血针刺破指尖或耳垂，用灭菌玻片的四个角（取2个即可）分别取血，
加入含有抗A及抗B标准血清的液体中
c.反应：经1～2 分钟后用肉眼观察结果，出现红细胞凝集颗粒者即为阳性反应；仍为均
匀混悬液者为阴性反应。

实验五：双向免疫扩散实验
1.实验原理：在含有电解质的凝胶中，可溶性抗原和相应抗体辐射扩散，形成浓度梯度，
在比例适合处形成肉眼可见的白色沉淀线。

一条沉淀线为一组特异性抗原抗体复合物。

2.结果分析：
a.沉淀线数量：对抗原抗体复合物只形成一条沉淀线；
b.沉淀线形状：沉淀线对于相应的抗原抗体是不可以通透的，对无关的抗原抗体是可以通
透的；沉淀线的外形与反应物的分子量有关，通常趋向分子量较大的一方
c.沉淀线位置：与反应物的相对浓度有关，通常靠近浓度小的一方
3.实验目的：检测病人血清中的甲胎蛋白（AFP）
4.实验试剂与器材：待测病人血清：待测1，待测2；阳性对照血清（p）；抗AFP诊断血
清；1.5％食盐琼脂；琼脂板、打孔器，微量加样器，湿盒
5.实验步骤：
a.第一步：铺板—将4ml琼脂倒入琼脂板中。

b.第二步：打孔—打7个小孔,约7mm间距。

c.第三步：加样—每空加样约10～15μl。

d.第四步：孵育—放入37℃温箱孵育约24小时。

6. 注意事项：倒胶要快速；打孔无裂缝；孔勿靠近琼脂边缘；加样不溢出；加样无气泡；
清洗加样器
7. 结果分析：阳性对照孔和样品孔分别与SRBC 小孔之间出现白色沉淀线。

两条沉淀线相会后融合在一起，说明
样品孔与阳性对照孔为相同成分。

实验六：小鼠巨噬细胞NO 的测定
1. 实验试剂与材料：NaNO2标准品（100μM ）；1640培养液；待测样品（1，2）； Griess
试剂：使用之前两液等量混合【NED 0.2% (0.02g ＋2.5％H3PO4 10ml )用超声波溶解，SA 2%(0.2g ＋2.5% H3PO4 10ml ) 】；微量加样器、枪头、板条。

2. 实验原理：
a. 巨噬细胞功能：强大的吞噬杀伤病原微生物的能力；重要的抗原提呈细胞，可摄取、加
工处理及提呈抗原，激发适应性免疫应答；活化的巨噬细胞分泌大量细胞因子、补体成分及NO 等，调控免疫应答。

b. 诱导型NO 合成酶（iNOS ）系统为巨噬细胞活化后所产生的反应性氮中间物。

iNOS 属
胞浆酶，在还原型辅酶II 或四氢生物蝶呤存在下，可催化L-精氨酸与氧分子反应，生成胍氨酸和NO 。

NO 与吞噬细胞氧化酶所产生的过氧化氢或过氧化物酶结合，在体内酸性环境中产生可杀伤细菌的过（氧化）亚硝酸盐基，其在酸性环境中与Griess 试剂中的磺胺和N-奈基乙二胺双氯化物进行重氮、偶氮反应，产生鲜艳橙红色产物。

因此通过Griess 法检测NO 的水平来反映巨噬细胞的活化程度。

3. 实验步骤：
a. 于孔2－8中每孔加入100μl 1640培养液
b. 于孔1中加入200μl NaNO2标准品
c. 从孔1中吸出100μl 加入2中，吹吸3次，再从2中吸出100μl 加入3中，吹吸3
次，再从3中吸出100μl 加入4中，吹吸3次，以此类推，直至第7孔，混匀后吸取100μl 弃掉。

1
P
2
A
1 2
P
7m m
d.于9和10中加入待测1，11和12中加入待测2，每孔100μl
e.Griess试剂，每孔100μl，室温10分钟，观测结果
实验七：小鼠外周血T细胞亚群的鉴定—流式细胞术
1.实验原理：
a.流式细胞术：（FlowCytometry，FCM）利用流式细胞仪对处在快速、直线、流动状态中
的单细胞或生物颗粒进行多参数、快速定量分析，同时对特定群体加以分选的现代细胞分析技术。

b.流式细胞仪特点：特异性好；灵敏度高（一般能测出单个细胞上<600个荧光分子,两个
细胞间的荧光差＞5%即可区分）；多参数分析（细胞大小，胞内颗粒丰富程度，荧光强弱）；快速采集分析（每秒可检测1000-5000细胞，甚至上万个细胞）；客观性；流式细胞仪的分选速度：一般流式细胞仪分选速度＞1000个/秒，分选细胞纯度可达99%以上c.流式细胞仪工作原理：将待测标本制备成单细胞悬液,经荧光标记抗体染色后由气压装
置送入流动室。

流动室由样品管和鞘液管组成,鞘液管充满流动的鞘液,鞘液流与样品流压力不等,当两者压力差达到一定程度时,鞘液裹挟着样品流迫使细胞有序地排列成单列,逐个进入激光聚焦区经激光束激发,产生散射光和荧光信号；通过一些波长选择通透性滤光片,即可将不同波长的散射光和荧光信号区分开来。

散射光和荧光信号接收后转换成数字信号送计算机处理,可在计算机上直观地统计染上各种荧光染料的细胞各自的百分率。

d.流式细胞仪应用：分选细胞（严格无菌操作）；分析细胞大小和内部复杂程度（颗粒
性）；检测细胞表面表型: 抗细胞表面抗原抗体, MHC 四聚体等；透化细胞后细胞内蛋白染色；追踪细胞和增殖(CFSE)；分析细胞内离子浓度；分析氧化还原(redox)电位；
分析细胞周期(用结合DNA的染料)；凋亡分析(annexin V, TUNEL etc)；细胞因子分泌实验(以及其后的分离)；多重蛋白分析实验
e.设立阴性对照管的意义：去除自发荧光，调节电压
f.设立单标管的意义：不同荧光之间会有叠加，必需通过调节补偿来校对。

g.设立同种型对照管的意义：用于消除由于抗体非特异性与细胞结合而产生的背景染色
h.同种型对照：是使用与一抗相同种属来源、相同亚型、相同剂量和相同的免疫球蛋白及
亚型的免疫球蛋白，用于消除由于抗体非特异性与细胞结合而产生的背景染色。

同种型对照是真正意思上的阴性对照。

2.实验试剂与器材：
a.昆明鼠
b.肝素（抗凝）
c.同种型对照抗体：CD3-FITC；CD4-PE；CD8-PerCP
d.荧光抗体：CD3-FITC；CD4-PE；CD8-PerCP
e.红细胞裂解液：0.17 mol NH4Cl，PBS液
f.眼科镊、微量加样器、微量离心管、枪头、流式管、离心机等。

3.实验步骤：
a.小鼠眼球取血后加肝素抗凝（100ul/管）
b.将血液分装到2支不同试管中，1号管加同种型对照的三个抗体，每个10ul; 2号管加
三种荧光抗体各10ul。

加荧光抗体后，室温静置5min
c.每管加红细胞裂解液1ml ，室温孵育5分钟
d.每管加2ml PBS，起到终止裂解，清洗作用
e.离心1500rpm, 6min
f.弃上清，加500ulPBS混匀，上样，待检
4.。