高效液相色谱法培训课件
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以胶束分散体系为流动相的色谱法称为胶束 色谱法。它的流动相为胶束多相分散体系， 不是真溶液；流动相中不含有机溶剂。
因胶束色谱法的流动相是多相分散体系，在 整个色谱体系中又增加了一相，故也被称为 假相色谱（pseudo phase
chromatography）。
手性色谱(chiral chromatography)
倒
前沿峰
峰
结果不能重现
表现为同一样品溶液连续进样所得峰面积 相差大，引起这种情况时，可从以下几 方面来查找原因：
泵、进样阀、管路漏液——造成峰面 积变化。
检测器灵敏度改变——如果同一样品 两次进样峰面积相差10倍或更大倍数， 则最可能的原因是检测器的灵敏度被 无意中改变，软件的灵敏度改变不会 影响峰面积的积分数值。
停用数天后最使用时，应先用低流速甲 醇冲洗1h左右，然后再换上流动相， 否则直接用流动相，柱效会下降，峰形 不好。
新柱使用前应用甲醇或乙腈冲洗 （0.5ml/min）。
色谱柱失效症状 色谱柱压增高 峰变宽，拖尾，裂峰 塔板数下降，选择性
下降，分离度降低 保留值减小或增大
色谱柱失效的原因 进口滤片堵塞 吸附了样品杂质 柱填充不良，使用久， 机械及热冲击造成空洞 固定相遭化学侵蚀
例20l定量圈，进样体积不能超过10 l。 否则，部分样品将会从出口流失。这是因为 由于层流的关系，样品流经管中心的速度是 平均速度的两倍。
进样前应用流动相冲洗进样孔，以除去前 一针留下的样品。注射针必须清洗干净。
检测器
紫外检测器 可变波长检测器 光电二极管阵列检测器
荧光检测器 电化学检测器 蒸发光散射 示差检测器 质谱
色谱软件积分方式是否一致——尤其是对 于色谱峰较复杂的，积分时基线稍有变化 将造成峰面积大的变化，如果两峰不是基 线分离，则峰切割方式对峰面积有很大影 响，有时候采用峰高较峰面积误差小。
最高操作温度60 ℃，最佳温度 ﹤40℃。
分离碱性物质，所用流动相pH值应高于被 测物pKa一个单位。
ZORBAX RP-HPLC系列柱的使用条件
柱
pH范围
最高温度
SB Leabharlann Baidu18
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
C8
C3 苯基
腈基
XDB
Extend-C18
90℃ 60℃ 60℃ 60℃ 60℃ 60℃ 60℃
注意
避免使用对不锈钢有腐蚀性的溶剂。 例：硝酸、硫酸、盐酸、卤化物， 四氯化碳与异丙醇或四氢呋喃的混 合物，含强络合剂的溶液等。
流动相 使用前
过滤——用滤
膜过滤或垂熔漏 斗过滤
脱气——采
用超声或过滤 的方法
使用含酸、碱、缓冲液的流动相后，
冲洗 必须用不含盐的有机溶剂-水冲洗！
▪进样阀
定量圈 1
离子对色谱（ion pair chromatography）— —将反离子加入流动相中，与呈解离状态的被 测物作用，生成脂溶性的中性离子对络合物， 从而增加了被测物在非极性固定相中的溶解度， 改善分离效果，达到分离目的。
常用反离子有：季铵盐 ——用于酸类
烷基磺酸盐——用于碱类
离子色谱法（ ion chromatography ）
离子色谱是由经典的离子交换色谱发 展起来的一种液相色谱技术，利用物 质在离子交换柱上迁移的差异而达到 分离，用于亲水性阴阳离子的测定。 根据是否采用抑制柱，可分为抑制型 离子色谱和非抑制型离子色谱。
空间排斥色谱（steric exclusion ）
也称凝胶色谱，依据被分离组分分子尺寸 与凝胶空径大小之间的相对关系而分离， 类似于分子筛作用。在一定分子线团尺寸 内，分子越大，保留时间越短。
键合相色谱pH控制在2-8
新型固定相
ZORBAX SB-C18键合相
使用独特的键合方式， 用特殊的二异丁基硅烷 对硅氧烷键进行保护， 防止了极端pH和高温条 件下键合相的水解，这 些大侧链阻止了键合相 的流失，提高了重现性， 延长了柱寿命。 注意：pH范围0.8-8.0，最高操作温度90℃，
缓冲液浓度0.01-0.02M，避免使用磷酸盐与碳酸盐
高效液相色谱法
第一节 概述
高效液相色谱法（HPLC）是60年代末以经 典液相色谱法为基础，引入了气相色谱的理 论与实验方法，流动相用高压泵输送，采用 高效固定相和在线检测等手段发展而成的分 离分析方法 。
与气相色谱法相比具有：适用范围广，样品 预处理简单，分离效率高，流动相选择范围 广，检测方法多为非破坏性的，流出组分可 回收等优点。
氨基柱、氰基柱、硅胶柱。
常用流动相为极性小的有机溶剂。
反相色谱（reversed phase）
流动相极性大于固定相极性的分配色谱法 称为反相分配色谱法。常用的分析柱有： ODS( C18)， C8， C2。
常用流动相为甲醇-水，乙腈-水。
离子抑制色谱（ion suppression chromatography）——调节流动相的pH值， 抑制组分的解离，增加组分在固定相中的溶解 度，改善峰形，以达到分离有机弱酸和弱碱的 目的。
进样方法
整个定量圈体积进样——为获得好的精密度， 进样量应大于定量圈量的2-5倍以上。由于
层流影响，需要有过量的样品液来取代管
壁上的流动相（见下图）。
Sample
Mobile phase
部分定量圈体积进样——当样品量少时， 采用部分体积进样，进样量由微量注射器 手动控制，要求：
不得超过定量圈体积的1/2量
喷雾 蒸发 检测
色谱柱流出物
N2
组分的 气溶胶
溶剂 光 源
泵
pH
调性注 节的意
，： 可不流 用能动 氨含相 水缓必 、冲须 醋盐是 酸，挥 。若发
质 谱 检 测 器
Flu
10%
Ms
1%
other 4%
Conduc 5%
Elec 7%
Refra 8%
DAD 22%
检
测
器
UV-VIS
使
43% 用
统
废液
定量圈 1
废液
泵2
6
泵2
6
废液 5
废液 5
3
4
进样孔
柱
3
4 进样孔
柱
Load
Inject
注意：使用后应清洗！
进样注意点
进样阀的废液出口端高度 必须与进样针在同一水平 位置，以免虹吸作用，使 样品向针筒方向回流，或 从废液口流出。
使用前后，要用流动相 （不含酸碱等缓冲液）或 甲醇或水冲洗针孔，用针 孔清洗器）。
更换色谱柱（厂家，型号）
进样操作不当
转动进样阀时应一次转到位，不能过慢或 停顿，否则易造成裂峰。
样品溶剂与流动相成分不匹配
样品溶剂与流动相成分不匹配，造成前沿 峰或倒峰。如样品用纯甲醇作溶剂，而流 动相中甲醇比例很低，这样易出现前沿峰， 改变样品溶剂成分或比例，使醇-水比例接 近于流动相。
Si(H) ∣
－C18H37
≡Si－O
低碳 R1=R2 = Cl
≡Si－O ≡Si－O－ Si－C18H37 ≡Si－O
中等极性键合相——常见的有醚基键合相， 这类键合相根据流动相的极性，可作为正 相或反相色谱的固定相，应用较少。
极性键合相——可作正相或反相色谱使用 氨基键合相： 硅胶-氨丙硅烷基[－Si－(CH2)3NH2] ▪ 氰基键合相： 硅胶-氰乙硅烷基[－Si－(CH2)2CN]
原因 压力
堵塞
#
空洞
吸附样品
化学冲击
拖尾 ## ##
#
塔板数 选择性
##
##
#
#
##
保留值 ##
柱凹陷——出现裂峰现象，填料与色谱柱顶端不齐 平，可用相同填料填平凹陷处。
压力影响——应避免突然的压力波动与任何的机械 与热力冲击，如色谱柱掉在实验台上或骤然改变柱 温等。进样过程中转动进样阀太慢引起压力波动， 会使色谱峰产生裂隙。
A
H
nm 光谱图
A-λ曲线 (定性)
min 色谱图
A-t 曲线 (定量)
蒸发光散射检测器
是通用检测器，适用于无紫外吸收的化合物。
原理：组分先引入已通气体（N2,空气 ）的 蒸发室，加热，使流动相蒸发而被除去，样 品组分形成气溶胶而产生光散射，测定散射 光强度而获得组分的浓度信号。
本法中流动相在检测前已蒸发，故梯度 洗脱基线稳定。
液-固吸附
正相色谱 一般反相色谱
液-液分配
反相色谱 离子对色谱
键
离子抑制色谱 一般离子交换色谱
合 相
色
离子交换色谱 离子色谱
谱
HPLC
氨基酸分析
空间排斥色谱
凝胶渗透色谱 凝胶过滤色谱
假相色谱
胶束色谱 环糊精色谱
亲合色谱，手性色谱，毛细管电泳
正相色谱（normal phase）
流动相极性小于固定相极性的分配色谱 法称为正相分配色谱。常用的分析柱有:
计
色谱柱
色谱柱有柱管和固定相组成，柱管用不 锈钢制成，柱长10～30cm，内径2～ 6mm，以4.6mm的内径最常用。
根据键合基团极性不同，化学键合相可 分为非极性、中等极性和极性三类。
常用色谱柱有：
ODS柱、氰基柱、氨基柱等
非极性键合相
表面基团为非极性烃基，如C18 、C8等， 主要用于RP色谱。 C18是最常用的非极 性键合相，将十八烷基氯硅烷与硅胶表 面的硅醇基经多步反应而成。
色谱柱使用与保存
所有色谱柱使用缓冲液后必须用柱体积 20-30倍的水冲洗色谱柱
色谱柱 150× 4.6mm 200× 4.6mm 250× 4.6mm
柱体积 2.5ml 3.3ml 4.2ml
冲洗体积 50ml 65ml 80ml
保存色谱柱时用100%甲醇或乙腈，柱 两端必须用接头密封。
凝胶渗透——以有机溶剂为流动相
凝胶过滤——以水溶液为流动相
对于相同化学组成的高分子化合物，其分 子尺寸大小与分子量成正比，因此凝胶色 谱可以研究高分子化合物的分子量分布。
胶束色谱(micellar chromatography)
表面活性剂在水中超过某一浓度（临界浓度） 时，多余的表面活性剂不再溶解，聚集而成 胶束（胶粒）。
ZORBAX Extend-C18色谱柱——采用C-18 二齿结构并用特有的步骤进行双基封端。
在pH高达11.5的条件下，用于分离碱性、 酸性、中性化合物，峰形优良，柱寿命长。
色谱柱使用注意点：
pH范围2-11.5。使用有机缓冲液，浓度以 10-50mM为好。在中高pH下避免使用磷 酸盐，碳酸盐缓冲液，
第二节 高效液相色谱仪
高压泵
流 动 相
脱气装置
进 样 阀
色 谱 柱
检测器
输液泵
多用柱塞往复泵，柱塞向前运动，液体输出， 流向色谱柱；向后运动，将贮液瓶中液体吸 入缸体。如此往复运动，将流动相 源源不断 地输送到色谱柱中。
柱塞往复泵属于恒流泵，流量不受柱阻影响， 泵压最高为400kg/cm2。
这种泵具有清洗容易，更换流动相方便等优 点，但脉动性较大是其缺点。目前多采用双 泵补偿法来克服这一问题。
样品纯度差——有微小的颗粒堵塞管路。 可用滤膜过滤样品后再进样。
样品浓度高——连续进样，造成过载。
如果样品吸收度不是太低，使样品浓度在 1mg/ml以下较适宜。
流动相中缓冲液浓度过高，有机相比例大—— 在色谱过程中堵塞管路，析出的盐结晶还磨损 泵、进样阀密封圈造成漏液。
缓冲液浓度一般控制在20mmol以下较适宜， 测定完毕后必须及时用水充分冲洗。
柱压升高原因
强保留样品组分——强吸附组分易聚集在柱进 口填料上，严重缩短色谱柱寿命。尤其是生物 样品提取物、含油成分等。当严重拖尾峰出现 时往往是强保留污染物在柱口处聚集的信号。
解决办法
使用保护柱可延长分析柱寿命。
每天实验后应用强溶剂（例甲醇-水等，至 少20-30倍柱体积的量）冲洗色谱柱。 并定期进行保养，以低流速的强溶剂较长 时间冲洗色谱柱。
注意！
一旦柱压升高，应停止测定，用水 冲洗数小时或更长时间，待压力下降后 再测定，如果不清楚堵在哪一段，则应 逐级检查，换泵头上滤芯，保护柱等。
柱效低的原因 频繁更换流动相组成——加速柱效降低。
最好一根色谱柱使用的流动相成分和pH值 相近，如始终在酸性条件下或碱性条件下 工作。
色谱柱的选择不合适或使用时间久
用于分离手性药物对映体的一种有效技 术，可分为直接法和间接法两类：
直接法
手性固定相法（chiral stationary phase;CSP)
手性流动相法(chiral mobile phase additive;CMPA)
间接法—手性试剂衍生化法 chiral derivatization reagent,CDR)
R1 Si OH + Cl Si C18H37
R2
1（2，3）：1
R1 Si O Si C18H37 + HCl
R2
R1，R2 =H，Cl ， CH3
根据R1、R2基团，含碳量可分为高碳、中碳、低 碳型键合相：
高碳 R1=R2 =CH3 载样量大，吸附性能大；
中碳 R1=H,
R2 =Cl
≡Si－O－
因胶束色谱法的流动相是多相分散体系，在 整个色谱体系中又增加了一相，故也被称为 假相色谱（pseudo phase
chromatography）。
手性色谱(chiral chromatography)
倒
前沿峰
峰
结果不能重现
表现为同一样品溶液连续进样所得峰面积 相差大，引起这种情况时，可从以下几 方面来查找原因：
泵、进样阀、管路漏液——造成峰面 积变化。
检测器灵敏度改变——如果同一样品 两次进样峰面积相差10倍或更大倍数， 则最可能的原因是检测器的灵敏度被 无意中改变，软件的灵敏度改变不会 影响峰面积的积分数值。
停用数天后最使用时，应先用低流速甲 醇冲洗1h左右，然后再换上流动相， 否则直接用流动相，柱效会下降，峰形 不好。
新柱使用前应用甲醇或乙腈冲洗 （0.5ml/min）。
色谱柱失效症状 色谱柱压增高 峰变宽，拖尾，裂峰 塔板数下降，选择性
下降，分离度降低 保留值减小或增大
色谱柱失效的原因 进口滤片堵塞 吸附了样品杂质 柱填充不良，使用久， 机械及热冲击造成空洞 固定相遭化学侵蚀
例20l定量圈，进样体积不能超过10 l。 否则，部分样品将会从出口流失。这是因为 由于层流的关系，样品流经管中心的速度是 平均速度的两倍。
进样前应用流动相冲洗进样孔，以除去前 一针留下的样品。注射针必须清洗干净。
检测器
紫外检测器 可变波长检测器 光电二极管阵列检测器
荧光检测器 电化学检测器 蒸发光散射 示差检测器 质谱
色谱软件积分方式是否一致——尤其是对 于色谱峰较复杂的，积分时基线稍有变化 将造成峰面积大的变化，如果两峰不是基 线分离，则峰切割方式对峰面积有很大影 响，有时候采用峰高较峰面积误差小。
最高操作温度60 ℃，最佳温度 ﹤40℃。
分离碱性物质，所用流动相pH值应高于被 测物pKa一个单位。
ZORBAX RP-HPLC系列柱的使用条件
柱
pH范围
最高温度
SB Leabharlann Baidu18
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
C8
C3 苯基
腈基
XDB
Extend-C18
90℃ 60℃ 60℃ 60℃ 60℃ 60℃ 60℃
注意
避免使用对不锈钢有腐蚀性的溶剂。 例：硝酸、硫酸、盐酸、卤化物， 四氯化碳与异丙醇或四氢呋喃的混 合物，含强络合剂的溶液等。
流动相 使用前
过滤——用滤
膜过滤或垂熔漏 斗过滤
脱气——采
用超声或过滤 的方法
使用含酸、碱、缓冲液的流动相后，
冲洗 必须用不含盐的有机溶剂-水冲洗！
▪进样阀
定量圈 1
离子对色谱（ion pair chromatography）— —将反离子加入流动相中，与呈解离状态的被 测物作用，生成脂溶性的中性离子对络合物， 从而增加了被测物在非极性固定相中的溶解度， 改善分离效果，达到分离目的。
常用反离子有：季铵盐 ——用于酸类
烷基磺酸盐——用于碱类
离子色谱法（ ion chromatography ）
离子色谱是由经典的离子交换色谱发 展起来的一种液相色谱技术，利用物 质在离子交换柱上迁移的差异而达到 分离，用于亲水性阴阳离子的测定。 根据是否采用抑制柱，可分为抑制型 离子色谱和非抑制型离子色谱。
空间排斥色谱（steric exclusion ）
也称凝胶色谱，依据被分离组分分子尺寸 与凝胶空径大小之间的相对关系而分离， 类似于分子筛作用。在一定分子线团尺寸 内，分子越大，保留时间越短。
键合相色谱pH控制在2-8
新型固定相
ZORBAX SB-C18键合相
使用独特的键合方式， 用特殊的二异丁基硅烷 对硅氧烷键进行保护， 防止了极端pH和高温条 件下键合相的水解，这 些大侧链阻止了键合相 的流失，提高了重现性， 延长了柱寿命。 注意：pH范围0.8-8.0，最高操作温度90℃，
缓冲液浓度0.01-0.02M，避免使用磷酸盐与碳酸盐
高效液相色谱法
第一节 概述
高效液相色谱法（HPLC）是60年代末以经 典液相色谱法为基础，引入了气相色谱的理 论与实验方法，流动相用高压泵输送，采用 高效固定相和在线检测等手段发展而成的分 离分析方法 。
与气相色谱法相比具有：适用范围广，样品 预处理简单，分离效率高，流动相选择范围 广，检测方法多为非破坏性的，流出组分可 回收等优点。
氨基柱、氰基柱、硅胶柱。
常用流动相为极性小的有机溶剂。
反相色谱（reversed phase）
流动相极性大于固定相极性的分配色谱法 称为反相分配色谱法。常用的分析柱有： ODS( C18)， C8， C2。
常用流动相为甲醇-水，乙腈-水。
离子抑制色谱（ion suppression chromatography）——调节流动相的pH值， 抑制组分的解离，增加组分在固定相中的溶解 度，改善峰形，以达到分离有机弱酸和弱碱的 目的。
进样方法
整个定量圈体积进样——为获得好的精密度， 进样量应大于定量圈量的2-5倍以上。由于
层流影响，需要有过量的样品液来取代管
壁上的流动相（见下图）。
Sample
Mobile phase
部分定量圈体积进样——当样品量少时， 采用部分体积进样，进样量由微量注射器 手动控制，要求：
不得超过定量圈体积的1/2量
喷雾 蒸发 检测
色谱柱流出物
N2
组分的 气溶胶
溶剂 光 源
泵
pH
调性注 节的意
，： 可不流 用能动 氨含相 水缓必 、冲须 醋盐是 酸，挥 。若发
质 谱 检 测 器
Flu
10%
Ms
1%
other 4%
Conduc 5%
Elec 7%
Refra 8%
DAD 22%
检
测
器
UV-VIS
使
43% 用
统
废液
定量圈 1
废液
泵2
6
泵2
6
废液 5
废液 5
3
4
进样孔
柱
3
4 进样孔
柱
Load
Inject
注意：使用后应清洗！
进样注意点
进样阀的废液出口端高度 必须与进样针在同一水平 位置，以免虹吸作用，使 样品向针筒方向回流，或 从废液口流出。
使用前后，要用流动相 （不含酸碱等缓冲液）或 甲醇或水冲洗针孔，用针 孔清洗器）。
更换色谱柱（厂家，型号）
进样操作不当
转动进样阀时应一次转到位，不能过慢或 停顿，否则易造成裂峰。
样品溶剂与流动相成分不匹配
样品溶剂与流动相成分不匹配，造成前沿 峰或倒峰。如样品用纯甲醇作溶剂，而流 动相中甲醇比例很低，这样易出现前沿峰， 改变样品溶剂成分或比例，使醇-水比例接 近于流动相。
Si(H) ∣
－C18H37
≡Si－O
低碳 R1=R2 = Cl
≡Si－O ≡Si－O－ Si－C18H37 ≡Si－O
中等极性键合相——常见的有醚基键合相， 这类键合相根据流动相的极性，可作为正 相或反相色谱的固定相，应用较少。
极性键合相——可作正相或反相色谱使用 氨基键合相： 硅胶-氨丙硅烷基[－Si－(CH2)3NH2] ▪ 氰基键合相： 硅胶-氰乙硅烷基[－Si－(CH2)2CN]
原因 压力
堵塞
#
空洞
吸附样品
化学冲击
拖尾 ## ##
#
塔板数 选择性
##
##
#
#
##
保留值 ##
柱凹陷——出现裂峰现象，填料与色谱柱顶端不齐 平，可用相同填料填平凹陷处。
压力影响——应避免突然的压力波动与任何的机械 与热力冲击，如色谱柱掉在实验台上或骤然改变柱 温等。进样过程中转动进样阀太慢引起压力波动， 会使色谱峰产生裂隙。
A
H
nm 光谱图
A-λ曲线 (定性)
min 色谱图
A-t 曲线 (定量)
蒸发光散射检测器
是通用检测器，适用于无紫外吸收的化合物。
原理：组分先引入已通气体（N2,空气 ）的 蒸发室，加热，使流动相蒸发而被除去，样 品组分形成气溶胶而产生光散射，测定散射 光强度而获得组分的浓度信号。
本法中流动相在检测前已蒸发，故梯度 洗脱基线稳定。
液-固吸附
正相色谱 一般反相色谱
液-液分配
反相色谱 离子对色谱
键
离子抑制色谱 一般离子交换色谱
合 相
色
离子交换色谱 离子色谱
谱
HPLC
氨基酸分析
空间排斥色谱
凝胶渗透色谱 凝胶过滤色谱
假相色谱
胶束色谱 环糊精色谱
亲合色谱，手性色谱，毛细管电泳
正相色谱（normal phase）
流动相极性小于固定相极性的分配色谱 法称为正相分配色谱。常用的分析柱有:
计
色谱柱
色谱柱有柱管和固定相组成，柱管用不 锈钢制成，柱长10～30cm，内径2～ 6mm，以4.6mm的内径最常用。
根据键合基团极性不同，化学键合相可 分为非极性、中等极性和极性三类。
常用色谱柱有：
ODS柱、氰基柱、氨基柱等
非极性键合相
表面基团为非极性烃基，如C18 、C8等， 主要用于RP色谱。 C18是最常用的非极 性键合相，将十八烷基氯硅烷与硅胶表 面的硅醇基经多步反应而成。
色谱柱使用与保存
所有色谱柱使用缓冲液后必须用柱体积 20-30倍的水冲洗色谱柱
色谱柱 150× 4.6mm 200× 4.6mm 250× 4.6mm
柱体积 2.5ml 3.3ml 4.2ml
冲洗体积 50ml 65ml 80ml
保存色谱柱时用100%甲醇或乙腈，柱 两端必须用接头密封。
凝胶渗透——以有机溶剂为流动相
凝胶过滤——以水溶液为流动相
对于相同化学组成的高分子化合物，其分 子尺寸大小与分子量成正比，因此凝胶色 谱可以研究高分子化合物的分子量分布。
胶束色谱(micellar chromatography)
表面活性剂在水中超过某一浓度（临界浓度） 时，多余的表面活性剂不再溶解，聚集而成 胶束（胶粒）。
ZORBAX Extend-C18色谱柱——采用C-18 二齿结构并用特有的步骤进行双基封端。
在pH高达11.5的条件下，用于分离碱性、 酸性、中性化合物，峰形优良，柱寿命长。
色谱柱使用注意点：
pH范围2-11.5。使用有机缓冲液，浓度以 10-50mM为好。在中高pH下避免使用磷 酸盐，碳酸盐缓冲液，
第二节 高效液相色谱仪
高压泵
流 动 相
脱气装置
进 样 阀
色 谱 柱
检测器
输液泵
多用柱塞往复泵，柱塞向前运动，液体输出， 流向色谱柱；向后运动，将贮液瓶中液体吸 入缸体。如此往复运动，将流动相 源源不断 地输送到色谱柱中。
柱塞往复泵属于恒流泵，流量不受柱阻影响， 泵压最高为400kg/cm2。
这种泵具有清洗容易，更换流动相方便等优 点，但脉动性较大是其缺点。目前多采用双 泵补偿法来克服这一问题。
样品纯度差——有微小的颗粒堵塞管路。 可用滤膜过滤样品后再进样。
样品浓度高——连续进样，造成过载。
如果样品吸收度不是太低，使样品浓度在 1mg/ml以下较适宜。
流动相中缓冲液浓度过高，有机相比例大—— 在色谱过程中堵塞管路，析出的盐结晶还磨损 泵、进样阀密封圈造成漏液。
缓冲液浓度一般控制在20mmol以下较适宜， 测定完毕后必须及时用水充分冲洗。
柱压升高原因
强保留样品组分——强吸附组分易聚集在柱进 口填料上，严重缩短色谱柱寿命。尤其是生物 样品提取物、含油成分等。当严重拖尾峰出现 时往往是强保留污染物在柱口处聚集的信号。
解决办法
使用保护柱可延长分析柱寿命。
每天实验后应用强溶剂（例甲醇-水等，至 少20-30倍柱体积的量）冲洗色谱柱。 并定期进行保养，以低流速的强溶剂较长 时间冲洗色谱柱。
注意！
一旦柱压升高，应停止测定，用水 冲洗数小时或更长时间，待压力下降后 再测定，如果不清楚堵在哪一段，则应 逐级检查，换泵头上滤芯，保护柱等。
柱效低的原因 频繁更换流动相组成——加速柱效降低。
最好一根色谱柱使用的流动相成分和pH值 相近，如始终在酸性条件下或碱性条件下 工作。
色谱柱的选择不合适或使用时间久
用于分离手性药物对映体的一种有效技 术，可分为直接法和间接法两类：
直接法
手性固定相法（chiral stationary phase;CSP)
手性流动相法(chiral mobile phase additive;CMPA)
间接法—手性试剂衍生化法 chiral derivatization reagent,CDR)
R1 Si OH + Cl Si C18H37
R2
1（2，3）：1
R1 Si O Si C18H37 + HCl
R2
R1，R2 =H，Cl ， CH3
根据R1、R2基团，含碳量可分为高碳、中碳、低 碳型键合相：
高碳 R1=R2 =CH3 载样量大，吸附性能大；
中碳 R1=H,
R2 =Cl
≡Si－O－