H克隆载体
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H克隆载体
南京工业大学制药学院 基因工程实验室
H1 质粒载体的设计 H2 噬菌体载体 粘粒、YAC与 H3 粘粒、YAC与BAC H4 真核生物载体
为什么要用载体？ 为什么要用载体？
基因克隆的重要环节，是把一个外源基因 导入生物细胞，并使它得到扩增。然而一个外 源DNA片段是很难进入受体细胞的，即使进入 细胞，一般也不能进行复制和功能的表达。这 是因为，所得到的外源DNA片断一般不带有复 制子系统及在新的受体细胞中进行功能表达的 调控系统。这样，进行基因克隆是极为困难的。
与pBR322质粒载体相比，pUC质粒载体系列具有许多方面 的优越性，是目前基因工程研究中最通用的大肠杆菌 克隆载体之一。 其优点概括起来有如下三个方面：
第一， 第一，具有更小的分子量和更高的拷贝数 第二， 第二，适用于组织化学方法检测重组体 第三，具有多克隆位点MCS MCS区 第三，具有多克隆位点MCS区
在酵母中筛选YAC或其他载体是利用与 不能产生某种基本代谢的突变菌株的互 补来进行的，即YAC载体上携带该突变基 因的正常拷贝可以互补这一缺陷。
细菌人工染色体（BAC） 细菌人工染色体（BAC）
基于大肠杆菌Fl因子的，在便于操 作的大肠杆菌宿主中能克隆长达350kb的 基因组DNA， 比YAC更稳定、易于操作。
基因工程载体共有的特性和基本要求
(1)在宿主细胞中能独立自主的复制，即 本身是复制子。 (2)容易从宿主细胞中分离纯化。 (3)载体DNA分子中有一段不影响它们扩 增的非必需区域，插在其中的外源基因 可以象载体的正常组分一样进行复制和 扩增。
作为理想的质粒载体， 作为理想的质粒载体，应具备以 下几个条件： 下几个条件：
pUC质粒载体的结构 pUC质粒载体的结构
此类质粒载体之所以取名为pUC，是 因为它是由美国加利福尼亚大学 California)的科学家 (University of California) J．Messing和J．Vieria于1987年首先构 建的。
pUC质粒载体的优点 pUC质粒载体的优点
λ置换型载体
包装与侵染
虽然很纯的环状 DNA或其衍生物可以与 质粒相同的方法转化感受态细胞，但噬菌体 颗粒的侵染性有其优点，特别是用于DNA文 库的构建，λ噬菌体在体内复制产生多拷贝 的λ基因组长线性分子。将这些多联体在 cos位点处切开，产生单个λ基因组，再被 包装进噬菌体颗粒。
噬菌体外壳蛋白及噬菌体DNA加工酶的混合液 (包装抽提液)在体外可将连接后的线性分子包装成 噬菌体颗粒。包装抽提液可从感染不同包装缺陷型 (突变)λ噬菌体的两个菌株来制备，因而抽提液中 的包装蛋白是丰富的。来自两个菌株的抽提混合液 提供了包装所需的所有蛋白。这样形成的噬菌体颗 粒可侵染正常的大肠杆菌细胞。不含插入片段的λ 末端连接物，或远远小于或远远大于最佳长度20kb 的插入片段的连接物对包装都是过小或过大，不能 被包装，同时含有两条左臂或两条右臂的重组体也 是不能生存的。侵染过程是非常有效的，且每毫克 载体DNA可以产生出多至109个重组体。
H4 真核生物载体
克隆到真核生物 转染真核细胞 穿梭载体
克隆到真核生物
许多基因克隆的应用都需要将基因 转入真核细胞并获得表达，不论是暂时 性还是永久性的。
已克隆插入片段的转录
在pUC载体上与克隆片段的插入位点相邻 pUC载体上与克隆片段的插入位点相邻 处有一个启动子(lac)， 处有一个启动子(lac)，很易想象出这样的启 动子可用来转录插入DNA，无论是在体外产生 动子可用来转录插入DNA， DNA 可用作杂交探针的RNA转录物， 可用作杂交探针的RNA转录物，还是表达插入 RNA转录物 片段内基因的蛋白产物，都不成问题。 片段内基因的蛋白产物，都不成问题。
(1) 能自主复制，即本身是复制子。 (2) 具有一种或多种限制酶的单一切割位 点，并在此位点中插入外源基因片段，不 影响本身的复制功能。 (3) 在基因组中有1—2个筛选标记，为寄 主细胞提供易于检测的表型特征。 (4) 分子量要小，多拷贝，易于操作。
H1 质粒载体的设计
连接产物 双抗生素抗性 蓝白颜色筛选 多克隆位点 已克隆插入片段的转录 表达载体
粘粒载体的应用： 粘粒载体的应用：
粘粒载体功能与λ噬菌体类似，但由于λ噬 λ λ 菌体具有较大的多功能种特定的情况下使用：①在单 个重组体中克隆和增殖完整的真核基因；②克隆 与分析组成某一基因家族的真核DNA区段，即当 载体克隆容量大具有明显优势时使用粘粒载体。
连接产物
将目的片段与质粒载体连接时，最常见 的非目标产物是线型载体片段自身环化 所形成的空质粒载体 可以通过酶解及随后的琼脂糖电泳与正 常的连接产物（重组体）加以区分
双抗生素抗性
pBR322是最早开发出来的质粒载体之一， 其特点是含有两个抗生素抗性基因 当目的基因插入其中任意一个编码区内， 该基因就会发生插入性失活，而后可以 通过转化子显示的抗生素抗性来鉴别重 组体
粘粒、YAC与 H3 粘粒、YAC与BAC
大片段DNA的克隆 大片段DNA的克隆 DNA 粘粒 酵母人工染色体（YAC） 酵母人工染色体（YAC） 细菌人工染色体（ 细菌人工染色体（BAC
大片段DNA的克隆 大片段DNA的克隆 DNA
对于庞大基因组的生物(如人类DNA有 3×109bp)，其基因组结构分析及基因鉴定很 难使用质粒和λ噬菌体载体来进行，因为使 用此类容量很小组。此外，一些由于较大 的内含子序列的真核生物基因也无法将整个 基因放在一个克隆片段中。为解决上述这些 问题，已开发出具有大DNA容量的载体。脉 冲场凝胶电泳(PFGE)的出现使大片段DNA的 分离、作图和分析成为可能。
酵母人工染色体（YAC） 酵母人工染色体（YAC）
将酵母染色体中为复制与分离所需 序列与大片段目的DNA连接而构成的，可 克隆外源片段的长度可大于1Mb。酵母人 工染色体(YAC)载体含有两个端粒序列 (TEL)、一个着丝粒(CEN)、一个自主复 制序列(ARS)以及能在酵母中用作筛选标 记的基因。
H2 噬菌体载体
λ噬菌体 λ置换型载体 包装与侵染
λ噬菌体
48.5kb的 基因组，在其末端有由12bp的粘 12bp 48.5kb的 λ基因组，在其末端有由12bp的粘 kb 末端构成的cos位点。cos位点是不对称的 cos位点 位点是不对称的， 末端构成的cos位点。cos位点是不对称的，但从 另一角度来看，cos位点相当于较长的(16bp) 位点相当于较长的(16bp)限制 另一角度来看，cos位点相当于较长的(16bp)限制 性位点，可以导致DNA在细胞内自身环化。 DNA在细胞内自身环化 性位点，可以导致DNA在细胞内自身环化。基因组 中心区域的大部分对侵染裂解都是不必要的， 中心区域的大部分对侵染裂解都是不必要的，可 以被不相关的DNA序列所替换。不过对插入噬菌体 以被不相关的DNA序列所替换。 DNA序列所替换 颗粒的DNA的大小是有一定限制的， DNA的总长 DNA的大小是有一定限制的 颗粒的DNA的大小是有一定限制的，即DNA的总长 度必须是原长度的75 75％ 105％之间， 37—52kb。 52kb 度必须是原长度的75％一105％之间，即37 52kb。 考虑到必要区域，可克隆进噬菌体的DNA DNA片段大约 考虑到必要区域，可克隆进噬菌体的DNA片段大约 20kb(最大23kb)左右 kb(最大23kb)左右， 为20kb(最大23kb)左右，远远大于可插入质粒载 体的片段。 体的片段。
粘粒（cosmid，柯斯质粒） 粘粒（cosmid，柯斯质粒）
粘粒用λ包装系统将于λcos位点结 合的大片段DNA包装起来，在侵染大肠杆 菌细胞后环化体能像质粒一样复制。某 些粘粒载体有两个cos位点，酶切产生的 两个cos末端，可与目的片段的两端连接， 然后包装入颗粒。粘粒克隆DNA的容量约 为30—45kb。
表达载体
可用pUC载体在大肠杆菌中表达克隆基因。 可用pUC载体在大肠杆菌中表达克隆基因。 pUC载体在大肠杆菌中表达克隆基因 这就需要将克隆片段在MCS MCS中定位以使目的基 这就需要将克隆片段在MCS中定位以使目的基 因的编码区与lacZ 基因具相同的可读框 lacZ‘基因具相同的可读框， 因的编码区与lacZ 基因具相同的可读框，并 且是连续不间断的。在诱导lac启动子转录后， lac启动子转录后 且是连续不间断的。在诱导lac启动子转录后， 产生融合蛋白 该融合蛋白是由来自lacZ' 融合蛋白， lacZ'的 产生融合蛋白，该融合蛋白是由来自lacZ'的N 端的几个氨基酸及其紧连着的由插入片段所编 码的蛋白序列组成。 码的蛋白序列组成。
多克隆位点(multiple
cloning site,MCS)
第一个利用蓝白颜色进行筛选的载体， 第一个利用蓝白颜色进行筛选的载体，同时也开 辟了多克隆位点（MCS）。这些质粒即pUC系列， ）。这些质粒即pUC系列 辟了多克隆位点（MCS）。这些质粒即pUC系列，包 含一个改造过的lacZ'基因， lacZ'基因 含一个改造过的lacZ'基因，在该基因编码区的第 一部分有多个限制酶酶切位点。 一部分有多个限制酶酶切位点。这一区域被称为 MCS。目的DNA DNA插入于这些位点中的任一个或任两个 MCS。目的DNA插入于这些位点中的任一个或任两个 位点之间，都会使lacZ'基因失活， lacZ'基因失活 位点之间，都会使lacZ'基因失活，井在适宜的平 板上产生白色菌落。MCS使在选择用于克隆的限制 板上产生白色菌落。MCS使在选择用于克隆的限制 酶时具有一定的灵活性。 酶时具有一定的灵活性。
柯斯质粒载体的构建
λ噬菌体克隆外源DNA的能力，虽说其理论上的 极限值可达23kb，但事实上较为有效的克隆范围仅 为15kb左右 15kb左右。当然，在一般的情况下，这样大小的 15kb左右 DNA片段已足够容纳一个完整的基因及其两端的侧翼 序列(flankingsequence)。然而，大量的研究资料 表明，许多基因的分子大小比正常预期的要大得多， 有的可达35～40kb甚至更大。同时，应用λ噬菌体 λ 作载体，还往往不能够同时克隆两个连锁的基因。 不言而喻，在实际的研究工作中，特别是有关真核 基因的结构与功能的研究，需要比λ噬菌体载体具 λ 有更大克隆能力的新型的载体。1978年， J．Collins及B．Hohn等人发展出的柯斯质粒载体 (eosmidvectors)满足了这样的需要。
Structu选 白颜色筛选
一种更巧妙的鉴定重组质粒的方法是蓝— 一种更巧妙的鉴定重组质粒的方法是蓝 白颜色筛选，该法可以在同一转化平板上完成 白颜色筛选， 筛选。这种方法也涉及基因的插入失活。 筛选。这种方法也涉及基因的插入失活。正如 名称所示， 名称所示，它利用一种蓝色化合物的形成作为 指示剂。在这种情况下失活基因是lacZ lacZ， 指示剂。在这种情况下失活基因是lacZ，该基 因编码β 半乳糖苷酶 半乳糖苷酶， lac启动子的调控 启动子的调控。 因编码β—半乳糖苷酶，受lac启动子的调控。 E.coli菌株表达lac阻抑物 菌株表达lac阻抑物， 当E.coli菌株表达lac阻抑物，则载体上的 lacZ基因由异丙基 基因由异丙基—β D 硫代半乳糖苷 lacZ基因由异丙基 β—D—硫代半乳糖苷 IPTG)诱导表达 诱导表达， (IPTG)诱导表达，表达形成的酶可以利用底物 吲哚—β D 半乳糖苷 5—溴—4—氯—3—吲哚 β—D—半乳糖苷 溴 4 氯 3 吲哚 （X－gal）形成一种蓝色化合物。重组质粒中 gal）形成一种蓝色化合物。 lacZ的插入失活将导致不能形成蓝色菌落 的插入失活将导致不能形成蓝色菌落。 lacZ的插入失活将导致不能形成蓝色菌落。
南京工业大学制药学院 基因工程实验室
H1 质粒载体的设计 H2 噬菌体载体 粘粒、YAC与 H3 粘粒、YAC与BAC H4 真核生物载体
为什么要用载体？ 为什么要用载体？
基因克隆的重要环节，是把一个外源基因 导入生物细胞，并使它得到扩增。然而一个外 源DNA片段是很难进入受体细胞的，即使进入 细胞，一般也不能进行复制和功能的表达。这 是因为，所得到的外源DNA片断一般不带有复 制子系统及在新的受体细胞中进行功能表达的 调控系统。这样，进行基因克隆是极为困难的。
与pBR322质粒载体相比，pUC质粒载体系列具有许多方面 的优越性，是目前基因工程研究中最通用的大肠杆菌 克隆载体之一。 其优点概括起来有如下三个方面：
第一， 第一，具有更小的分子量和更高的拷贝数 第二， 第二，适用于组织化学方法检测重组体 第三，具有多克隆位点MCS MCS区 第三，具有多克隆位点MCS区
在酵母中筛选YAC或其他载体是利用与 不能产生某种基本代谢的突变菌株的互 补来进行的，即YAC载体上携带该突变基 因的正常拷贝可以互补这一缺陷。
细菌人工染色体（BAC） 细菌人工染色体（BAC）
基于大肠杆菌Fl因子的，在便于操 作的大肠杆菌宿主中能克隆长达350kb的 基因组DNA， 比YAC更稳定、易于操作。
基因工程载体共有的特性和基本要求
(1)在宿主细胞中能独立自主的复制，即 本身是复制子。 (2)容易从宿主细胞中分离纯化。 (3)载体DNA分子中有一段不影响它们扩 增的非必需区域，插在其中的外源基因 可以象载体的正常组分一样进行复制和 扩增。
作为理想的质粒载体， 作为理想的质粒载体，应具备以 下几个条件： 下几个条件：
pUC质粒载体的结构 pUC质粒载体的结构
此类质粒载体之所以取名为pUC，是 因为它是由美国加利福尼亚大学 California)的科学家 (University of California) J．Messing和J．Vieria于1987年首先构 建的。
pUC质粒载体的优点 pUC质粒载体的优点
λ置换型载体
包装与侵染
虽然很纯的环状 DNA或其衍生物可以与 质粒相同的方法转化感受态细胞，但噬菌体 颗粒的侵染性有其优点，特别是用于DNA文 库的构建，λ噬菌体在体内复制产生多拷贝 的λ基因组长线性分子。将这些多联体在 cos位点处切开，产生单个λ基因组，再被 包装进噬菌体颗粒。
噬菌体外壳蛋白及噬菌体DNA加工酶的混合液 (包装抽提液)在体外可将连接后的线性分子包装成 噬菌体颗粒。包装抽提液可从感染不同包装缺陷型 (突变)λ噬菌体的两个菌株来制备，因而抽提液中 的包装蛋白是丰富的。来自两个菌株的抽提混合液 提供了包装所需的所有蛋白。这样形成的噬菌体颗 粒可侵染正常的大肠杆菌细胞。不含插入片段的λ 末端连接物，或远远小于或远远大于最佳长度20kb 的插入片段的连接物对包装都是过小或过大，不能 被包装，同时含有两条左臂或两条右臂的重组体也 是不能生存的。侵染过程是非常有效的，且每毫克 载体DNA可以产生出多至109个重组体。
H4 真核生物载体
克隆到真核生物 转染真核细胞 穿梭载体
克隆到真核生物
许多基因克隆的应用都需要将基因 转入真核细胞并获得表达，不论是暂时 性还是永久性的。
已克隆插入片段的转录
在pUC载体上与克隆片段的插入位点相邻 pUC载体上与克隆片段的插入位点相邻 处有一个启动子(lac)， 处有一个启动子(lac)，很易想象出这样的启 动子可用来转录插入DNA，无论是在体外产生 动子可用来转录插入DNA， DNA 可用作杂交探针的RNA转录物， 可用作杂交探针的RNA转录物，还是表达插入 RNA转录物 片段内基因的蛋白产物，都不成问题。 片段内基因的蛋白产物，都不成问题。
(1) 能自主复制，即本身是复制子。 (2) 具有一种或多种限制酶的单一切割位 点，并在此位点中插入外源基因片段，不 影响本身的复制功能。 (3) 在基因组中有1—2个筛选标记，为寄 主细胞提供易于检测的表型特征。 (4) 分子量要小，多拷贝，易于操作。
H1 质粒载体的设计
连接产物 双抗生素抗性 蓝白颜色筛选 多克隆位点 已克隆插入片段的转录 表达载体
粘粒载体的应用： 粘粒载体的应用：
粘粒载体功能与λ噬菌体类似，但由于λ噬 λ λ 菌体具有较大的多功能种特定的情况下使用：①在单 个重组体中克隆和增殖完整的真核基因；②克隆 与分析组成某一基因家族的真核DNA区段，即当 载体克隆容量大具有明显优势时使用粘粒载体。
连接产物
将目的片段与质粒载体连接时，最常见 的非目标产物是线型载体片段自身环化 所形成的空质粒载体 可以通过酶解及随后的琼脂糖电泳与正 常的连接产物（重组体）加以区分
双抗生素抗性
pBR322是最早开发出来的质粒载体之一， 其特点是含有两个抗生素抗性基因 当目的基因插入其中任意一个编码区内， 该基因就会发生插入性失活，而后可以 通过转化子显示的抗生素抗性来鉴别重 组体
粘粒、YAC与 H3 粘粒、YAC与BAC
大片段DNA的克隆 大片段DNA的克隆 DNA 粘粒 酵母人工染色体（YAC） 酵母人工染色体（YAC） 细菌人工染色体（ 细菌人工染色体（BAC
大片段DNA的克隆 大片段DNA的克隆 DNA
对于庞大基因组的生物(如人类DNA有 3×109bp)，其基因组结构分析及基因鉴定很 难使用质粒和λ噬菌体载体来进行，因为使 用此类容量很小组。此外，一些由于较大 的内含子序列的真核生物基因也无法将整个 基因放在一个克隆片段中。为解决上述这些 问题，已开发出具有大DNA容量的载体。脉 冲场凝胶电泳(PFGE)的出现使大片段DNA的 分离、作图和分析成为可能。
酵母人工染色体（YAC） 酵母人工染色体（YAC）
将酵母染色体中为复制与分离所需 序列与大片段目的DNA连接而构成的，可 克隆外源片段的长度可大于1Mb。酵母人 工染色体(YAC)载体含有两个端粒序列 (TEL)、一个着丝粒(CEN)、一个自主复 制序列(ARS)以及能在酵母中用作筛选标 记的基因。
H2 噬菌体载体
λ噬菌体 λ置换型载体 包装与侵染
λ噬菌体
48.5kb的 基因组，在其末端有由12bp的粘 12bp 48.5kb的 λ基因组，在其末端有由12bp的粘 kb 末端构成的cos位点。cos位点是不对称的 cos位点 位点是不对称的， 末端构成的cos位点。cos位点是不对称的，但从 另一角度来看，cos位点相当于较长的(16bp) 位点相当于较长的(16bp)限制 另一角度来看，cos位点相当于较长的(16bp)限制 性位点，可以导致DNA在细胞内自身环化。 DNA在细胞内自身环化 性位点，可以导致DNA在细胞内自身环化。基因组 中心区域的大部分对侵染裂解都是不必要的， 中心区域的大部分对侵染裂解都是不必要的，可 以被不相关的DNA序列所替换。不过对插入噬菌体 以被不相关的DNA序列所替换。 DNA序列所替换 颗粒的DNA的大小是有一定限制的， DNA的总长 DNA的大小是有一定限制的 颗粒的DNA的大小是有一定限制的，即DNA的总长 度必须是原长度的75 75％ 105％之间， 37—52kb。 52kb 度必须是原长度的75％一105％之间，即37 52kb。 考虑到必要区域，可克隆进噬菌体的DNA DNA片段大约 考虑到必要区域，可克隆进噬菌体的DNA片段大约 20kb(最大23kb)左右 kb(最大23kb)左右， 为20kb(最大23kb)左右，远远大于可插入质粒载 体的片段。 体的片段。
粘粒（cosmid，柯斯质粒） 粘粒（cosmid，柯斯质粒）
粘粒用λ包装系统将于λcos位点结 合的大片段DNA包装起来，在侵染大肠杆 菌细胞后环化体能像质粒一样复制。某 些粘粒载体有两个cos位点，酶切产生的 两个cos末端，可与目的片段的两端连接， 然后包装入颗粒。粘粒克隆DNA的容量约 为30—45kb。
表达载体
可用pUC载体在大肠杆菌中表达克隆基因。 可用pUC载体在大肠杆菌中表达克隆基因。 pUC载体在大肠杆菌中表达克隆基因 这就需要将克隆片段在MCS MCS中定位以使目的基 这就需要将克隆片段在MCS中定位以使目的基 因的编码区与lacZ 基因具相同的可读框 lacZ‘基因具相同的可读框， 因的编码区与lacZ 基因具相同的可读框，并 且是连续不间断的。在诱导lac启动子转录后， lac启动子转录后 且是连续不间断的。在诱导lac启动子转录后， 产生融合蛋白 该融合蛋白是由来自lacZ' 融合蛋白， lacZ'的 产生融合蛋白，该融合蛋白是由来自lacZ'的N 端的几个氨基酸及其紧连着的由插入片段所编 码的蛋白序列组成。 码的蛋白序列组成。
多克隆位点(multiple
cloning site,MCS)
第一个利用蓝白颜色进行筛选的载体， 第一个利用蓝白颜色进行筛选的载体，同时也开 辟了多克隆位点（MCS）。这些质粒即pUC系列， ）。这些质粒即pUC系列 辟了多克隆位点（MCS）。这些质粒即pUC系列，包 含一个改造过的lacZ'基因， lacZ'基因 含一个改造过的lacZ'基因，在该基因编码区的第 一部分有多个限制酶酶切位点。 一部分有多个限制酶酶切位点。这一区域被称为 MCS。目的DNA DNA插入于这些位点中的任一个或任两个 MCS。目的DNA插入于这些位点中的任一个或任两个 位点之间，都会使lacZ'基因失活， lacZ'基因失活 位点之间，都会使lacZ'基因失活，井在适宜的平 板上产生白色菌落。MCS使在选择用于克隆的限制 板上产生白色菌落。MCS使在选择用于克隆的限制 酶时具有一定的灵活性。 酶时具有一定的灵活性。
柯斯质粒载体的构建
λ噬菌体克隆外源DNA的能力，虽说其理论上的 极限值可达23kb，但事实上较为有效的克隆范围仅 为15kb左右 15kb左右。当然，在一般的情况下，这样大小的 15kb左右 DNA片段已足够容纳一个完整的基因及其两端的侧翼 序列(flankingsequence)。然而，大量的研究资料 表明，许多基因的分子大小比正常预期的要大得多， 有的可达35～40kb甚至更大。同时，应用λ噬菌体 λ 作载体，还往往不能够同时克隆两个连锁的基因。 不言而喻，在实际的研究工作中，特别是有关真核 基因的结构与功能的研究，需要比λ噬菌体载体具 λ 有更大克隆能力的新型的载体。1978年， J．Collins及B．Hohn等人发展出的柯斯质粒载体 (eosmidvectors)满足了这样的需要。
Structu选 白颜色筛选
一种更巧妙的鉴定重组质粒的方法是蓝— 一种更巧妙的鉴定重组质粒的方法是蓝 白颜色筛选，该法可以在同一转化平板上完成 白颜色筛选， 筛选。这种方法也涉及基因的插入失活。 筛选。这种方法也涉及基因的插入失活。正如 名称所示， 名称所示，它利用一种蓝色化合物的形成作为 指示剂。在这种情况下失活基因是lacZ lacZ， 指示剂。在这种情况下失活基因是lacZ，该基 因编码β 半乳糖苷酶 半乳糖苷酶， lac启动子的调控 启动子的调控。 因编码β—半乳糖苷酶，受lac启动子的调控。 E.coli菌株表达lac阻抑物 菌株表达lac阻抑物， 当E.coli菌株表达lac阻抑物，则载体上的 lacZ基因由异丙基 基因由异丙基—β D 硫代半乳糖苷 lacZ基因由异丙基 β—D—硫代半乳糖苷 IPTG)诱导表达 诱导表达， (IPTG)诱导表达，表达形成的酶可以利用底物 吲哚—β D 半乳糖苷 5—溴—4—氯—3—吲哚 β—D—半乳糖苷 溴 4 氯 3 吲哚 （X－gal）形成一种蓝色化合物。重组质粒中 gal）形成一种蓝色化合物。 lacZ的插入失活将导致不能形成蓝色菌落 的插入失活将导致不能形成蓝色菌落。 lacZ的插入失活将导致不能形成蓝色菌落。