环境分析仪器 HPLC在环境分析中的应用
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处理软硬件。
13
HPLC仪器结构示意
He
HPLC仪器详解
出口检查
储液瓶
分布器 过滤 2m
高压泵
脉流消除
入口检查
抽气
到检测器
分离柱
压力计 注样阀
反压调节
过滤器
14
进样器 接头 色谱柱 检测器 数据系统
15
可优化的HPLC条件
输液系统 液相运行程序
–梯度方法 –等度方法
10
流动相流速对GC与HPLC板高影响的差别
GC H
1
2
3
45
HPLC
u
柱效与柱填料粒径关系
12
高效液相色谱仪构成（五部分）
输液系统 恒流泵和恒压泵，单元泵和多元比例泵等 梯度洗脱
进样系统：进样器、六通阀等； 分离系统：色谱柱和梯度洗脱控制装置； 检测系统：检测器、信号放大器装置等； 数据处理系统：记录仪或数据采集、数据
7
色谱分离示意图
8
高效液相色谱法的分类
HPLC
按固定 相分类
按分离 机理分类
液液色谱法LLC
液固色谱法LSC
分配色谱法 吸附色谱法 离子交换色谱法 分子排阻色谱法 化学键合色谱法 亲合色谱法 胶束色谱法
9
高效液相色谱法理论基础
基本概念及理论基础，如保留值、分配系数、分配比、分离度、 塔板理论等与气相色谱法是一致的；
高压泵：对输液泵的要求：密封性好、输液流量稳定无 脉动、可调范围宽、耐腐蚀。
17
高压输液系统
高压输液泵种类： 机械注射泵：单元泵，溶剂更换不便 多元比例泵：可根据需要进行流动相比例的调整
恒压型和恒流型： 恒压泵 (类似于风箱)可迅速获得高压，适于柱的匀 浆 填充。但因泵腔体积大，在往复推动时，会引起脉 动， 且输出流量随色谱系统阻力（主要是柱填充物） 变化而 变化，现已较少使用。 恒流型 溶剂流量恒定，与柱填充情况无关，使用较多。 有机械注射式和机械往复式两种。
硅胶
IV. “封尾”
高 速 由于采用高压输液设备，载液流速快，因而所 需的 分析时间较之经典液体色谱法少得多，多数小于 1h，一般为 1-10 ml/min ；
高 效 柱效很高，填充物颗粒极细且规则，固定相涂渍均 匀、传质阻力小，因而柱效很高。可以在数分钟内完成 数百种物质的分离，约可达3万塔板/米以上。
高灵敏度 由于采用高灵敏度的检测器，紫外检测器最小 检测量可达10-9g，荧光可达10-11g ，所需试样量较少。
HPLC在环境分析中的应用
1
HLPC与经典液相色谱和气相的比较
气相色谱
高效液相色谱
只能分析挥发性物质，只能分析 20%的化合物
几乎可以分析各种物质
不能分析热不稳定物质
可以分析热不稳定物质
用毛细管色谱可得到很高的柱效 色谱柱不能很长，柱效不会很高
有很灵敏的检测器如ECD和较灵 敏的通用检测器(FID和TCD)
流速 进样量 色谱柱及柱温 检测器
16
输液系统
保证流动相能正常工作，有流动相储瓶、脱气装置、
高压泵和梯度程序控制器组成。在HPLC中，流动相的
选择性比较强，选择范围也比较大。
贮液器：1-2L的玻璃瓶，配有溶剂过滤器(Ni合金)，其 孔径约2 m，可防止颗粒物进入泵内。
脱气：超声波脱气或真空加热脱气。溶剂通过脱气器中 的脱气膜，相对分子量小的气体透过膜从溶剂中除去 （气泡会影响检测）。
柱内径： 1~6mm
进样量： 1~100l（可分流调节）
22
分离原理
原理：组分在固定相和流动相上的分配
流动相：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即
流动相的极性小于固定液的极性（正相 Normal phase ），反之，流动相的极性大于固定液的极性（反相 Reverse phase）。正相与反相的出峰顺序相反；
固定相：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用；
化学键合固定相：将各种不同基团通过化学反应键合到 硅胶（担体）表面的游离羟基上，如C-18柱。
23
色谱柱类型
25
色谱柱改进——保护柱作用
26
典型的柱流速设定
27
28
液相色谱固定相
化学键合固定相: 目前应用最广、性能最佳的固定相； a. 硅氧碳键型： ≡Si—O—C b. 硅氧硅碳键型：≡Si—O—Si — C 稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广； c. 硅碳键型： ≡Si—C d. 硅氮键型： ≡Si—N
29
各种不同的混合基质制作方式
反相 – 蓝色; 离子交换 –红色
硅胶
I. 混合填料
Hypersil Duet C18/SAX (Thermo Scientific)
II. 混合键合
Alltech Mixed-Mode (Grace)
硅胶
III. “内嵌”
Primesep Mixed-Mode (SIELC)
流动相为液体，液体的扩散系数与气体有很大不同，比较如下
表:
H A B C
参数 扩散系数 Dm/cm2·s-1
密度 ρ/g·cm-3
粘度 /g·(cm·s)-1
气体 10-1 10-3 10-4
液体 10-5
1 10-2
H- 曲线 与气相色谱有很大不同，因为分子扩散A相对 H 实际
上已不起作用所致。随着填料颗粒度的不断减小（< 10 m）, 两者的曲线形式基本相似。
5
高效液相色谱法
High Performance Liquid Chromatography
高效液相色谱法是在气相色谱的基础上发展起来的， 是色谱技术的一个分支。
6
高效液相色谱的特点
高 压 以液体作为流动相，由于载液流经色谱柱时，受 到 阻力较大，为了使载液迅速通过色谱柱，必须对载 液施加高 压，压力一般达150–350×105 Pa；
18
输液泵
进样阀
19
六通阀进样器手动进样（平头针）
标准注射针 针头可换式注射器
自动进样装置
20
进样系统
进样定量管
21
柱分离系统
色谱分离系统包括色谱柱和梯度控制两大部分。 欲得到满意的分离效果，关键是选用合适的色谱 柱。色谱柱分为填充柱和毛细柱两大类。 填充柱：不锈钢，内壁抛光（8）。 柱长度：5~25cm
没有较高灵敏的通用检测器
流动相为气体，无毒，易于处理 流动相有毒，费用较高
运行和操作容易 仪器制造难度较小
运行和操作比GC难一些 仪器制造难度大
2
高效液相色谱法
20世纪70年代高效液相色谱法崛起，为难挥发、 热不稳定和高分子样品的分析提供了有效手段。
3
高效液相色谱的发展史
4
气相色谱法与液相色谱法的选择
13
HPLC仪器结构示意
He
HPLC仪器详解
出口检查
储液瓶
分布器 过滤 2m
高压泵
脉流消除
入口检查
抽气
到检测器
分离柱
压力计 注样阀
反压调节
过滤器
14
进样器 接头 色谱柱 检测器 数据系统
15
可优化的HPLC条件
输液系统 液相运行程序
–梯度方法 –等度方法
10
流动相流速对GC与HPLC板高影响的差别
GC H
1
2
3
45
HPLC
u
柱效与柱填料粒径关系
12
高效液相色谱仪构成（五部分）
输液系统 恒流泵和恒压泵，单元泵和多元比例泵等 梯度洗脱
进样系统：进样器、六通阀等； 分离系统：色谱柱和梯度洗脱控制装置； 检测系统：检测器、信号放大器装置等； 数据处理系统：记录仪或数据采集、数据
7
色谱分离示意图
8
高效液相色谱法的分类
HPLC
按固定 相分类
按分离 机理分类
液液色谱法LLC
液固色谱法LSC
分配色谱法 吸附色谱法 离子交换色谱法 分子排阻色谱法 化学键合色谱法 亲合色谱法 胶束色谱法
9
高效液相色谱法理论基础
基本概念及理论基础，如保留值、分配系数、分配比、分离度、 塔板理论等与气相色谱法是一致的；
高压泵：对输液泵的要求：密封性好、输液流量稳定无 脉动、可调范围宽、耐腐蚀。
17
高压输液系统
高压输液泵种类： 机械注射泵：单元泵，溶剂更换不便 多元比例泵：可根据需要进行流动相比例的调整
恒压型和恒流型： 恒压泵 (类似于风箱)可迅速获得高压，适于柱的匀 浆 填充。但因泵腔体积大，在往复推动时，会引起脉 动， 且输出流量随色谱系统阻力（主要是柱填充物） 变化而 变化，现已较少使用。 恒流型 溶剂流量恒定，与柱填充情况无关，使用较多。 有机械注射式和机械往复式两种。
硅胶
IV. “封尾”
高 速 由于采用高压输液设备，载液流速快，因而所 需的 分析时间较之经典液体色谱法少得多，多数小于 1h，一般为 1-10 ml/min ；
高 效 柱效很高，填充物颗粒极细且规则，固定相涂渍均 匀、传质阻力小，因而柱效很高。可以在数分钟内完成 数百种物质的分离，约可达3万塔板/米以上。
高灵敏度 由于采用高灵敏度的检测器，紫外检测器最小 检测量可达10-9g，荧光可达10-11g ，所需试样量较少。
HPLC在环境分析中的应用
1
HLPC与经典液相色谱和气相的比较
气相色谱
高效液相色谱
只能分析挥发性物质，只能分析 20%的化合物
几乎可以分析各种物质
不能分析热不稳定物质
可以分析热不稳定物质
用毛细管色谱可得到很高的柱效 色谱柱不能很长，柱效不会很高
有很灵敏的检测器如ECD和较灵 敏的通用检测器(FID和TCD)
流速 进样量 色谱柱及柱温 检测器
16
输液系统
保证流动相能正常工作，有流动相储瓶、脱气装置、
高压泵和梯度程序控制器组成。在HPLC中，流动相的
选择性比较强，选择范围也比较大。
贮液器：1-2L的玻璃瓶，配有溶剂过滤器(Ni合金)，其 孔径约2 m，可防止颗粒物进入泵内。
脱气：超声波脱气或真空加热脱气。溶剂通过脱气器中 的脱气膜，相对分子量小的气体透过膜从溶剂中除去 （气泡会影响检测）。
柱内径： 1~6mm
进样量： 1~100l（可分流调节）
22
分离原理
原理：组分在固定相和流动相上的分配
流动相：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即
流动相的极性小于固定液的极性（正相 Normal phase ），反之，流动相的极性大于固定液的极性（反相 Reverse phase）。正相与反相的出峰顺序相反；
固定相：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用；
化学键合固定相：将各种不同基团通过化学反应键合到 硅胶（担体）表面的游离羟基上，如C-18柱。
23
色谱柱类型
25
色谱柱改进——保护柱作用
26
典型的柱流速设定
27
28
液相色谱固定相
化学键合固定相: 目前应用最广、性能最佳的固定相； a. 硅氧碳键型： ≡Si—O—C b. 硅氧硅碳键型：≡Si—O—Si — C 稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广； c. 硅碳键型： ≡Si—C d. 硅氮键型： ≡Si—N
29
各种不同的混合基质制作方式
反相 – 蓝色; 离子交换 –红色
硅胶
I. 混合填料
Hypersil Duet C18/SAX (Thermo Scientific)
II. 混合键合
Alltech Mixed-Mode (Grace)
硅胶
III. “内嵌”
Primesep Mixed-Mode (SIELC)
流动相为液体，液体的扩散系数与气体有很大不同，比较如下
表:
H A B C
参数 扩散系数 Dm/cm2·s-1
密度 ρ/g·cm-3
粘度 /g·(cm·s)-1
气体 10-1 10-3 10-4
液体 10-5
1 10-2
H- 曲线 与气相色谱有很大不同，因为分子扩散A相对 H 实际
上已不起作用所致。随着填料颗粒度的不断减小（< 10 m）, 两者的曲线形式基本相似。
5
高效液相色谱法
High Performance Liquid Chromatography
高效液相色谱法是在气相色谱的基础上发展起来的， 是色谱技术的一个分支。
6
高效液相色谱的特点
高 压 以液体作为流动相，由于载液流经色谱柱时，受 到 阻力较大，为了使载液迅速通过色谱柱，必须对载 液施加高 压，压力一般达150–350×105 Pa；
18
输液泵
进样阀
19
六通阀进样器手动进样（平头针）
标准注射针 针头可换式注射器
自动进样装置
20
进样系统
进样定量管
21
柱分离系统
色谱分离系统包括色谱柱和梯度控制两大部分。 欲得到满意的分离效果，关键是选用合适的色谱 柱。色谱柱分为填充柱和毛细柱两大类。 填充柱：不锈钢，内壁抛光（8）。 柱长度：5~25cm
没有较高灵敏的通用检测器
流动相为气体，无毒，易于处理 流动相有毒，费用较高
运行和操作容易 仪器制造难度较小
运行和操作比GC难一些 仪器制造难度大
2
高效液相色谱法
20世纪70年代高效液相色谱法崛起，为难挥发、 热不稳定和高分子样品的分析提供了有效手段。
3
高效液相色谱的发展史
4
气相色谱法与液相色谱法的选择