酶联免疫吸附试验(ELISA)

前两种方法主要用于测定抗体和大分 子抗原，适用于临床诊断上，而竞争法事 测定小分子抗原的方法，因而尤其适用于 食品分析。
ELIZA 方法图示
间接法
“Indirect” ELISA
The steps of "indirect" ELISA follows the mechanism below: 1. A buffered solution of the protein antigen to be tested for is added to each well of a microtiter plate, where it is given time to adhere to the plastic through charge interactions. 2. A solution of non-reacting protein, such as bovine serum albumin, or casein is added to block any plastic surface in the well that remains uncoated by the protein antigen. 3. Then the serum is added, which contains a mixture of the serum donor's antibodies, of unknown concentration, some of which may bind specifically to the test antigen that is coating the well. 4. Afterwards, a secondary antibody is added, which will bind any antibody produced by a member of the donor's species (for example, an antibody produced in a mouse that will bind any rabbit antibody). This secondary antibody often has an enzyme attached to it, which has no effect on the binding properties of the antibody. 5. A substrate for this enzyme is then added. Often, this substrate changes color upon reaction with the enzyme. The color change shows that secondary antibody has bound to primary antibody, which strongly implies that the donor has had an immune reaction to the test antigen. This can be helpful in a clinical setting, and in R&D. 6. The higher the concentration of the primary antibody that was present in the serum, the stronger the color change. Often a spectrometer is used to give quantitative values for color strength
1.固定载体 固相载体在ELISA测定过程中作为吸 附剂和容器，不参与化学反应。可作 ELISA中载体的材料很多，最常用的是聚 苯乙烯。ELISA载体的形状主要有三种： 微量滴定板、小珠和小试管。以微量滴 定板最为常用，专用于EILSA的产品称为 ELISA板，国际上标准的微量滴定板为 8×12的96孔式。
6. 酶反应终止液 常用的HRP反应终止液为硫酸，其浓 度按加量及比色液的最终体积而异，在板 式ELISA中一般采用2mol/L。 7.参考标准品 定量测定的ELISA试剂盒应含有制作 标准曲线用的参考标准品，应包括覆盖可 检测范围的4-5个浓度，一般均配入含蛋 白保护剂及防腐剂的缓冲液中。
ELISA测定方法 ELISA测定方法
ELISA基本原理 ELISA基本原理
使抗原或抗体结合到某种固相载体表面， 并保持其免疫活性（固相抗原／抗体的形 成）
在测定时，把受检标本（测定其中的抗 体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步 骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应 （抗原抗体反应）
用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原 抗体复合物与干扰物质分开，最后结合在固 相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一 定的比例。（酶标抗原抗体复合物的分离）
2. 免疫吸附剂 已包被抗原或抗体的固相载体，是 ELISA方法中的核心试剂。
3. 酶标记物 即酶标记的抗原或抗体，是ELISA中 最关键的试剂。良好的酶标记物应该是既 保有酶的催化活性，也保持了抗体（或抗 原）的免疫活性。 酶标记物中酶与抗体（或抗原）之间 有恰当的分子比例，在酶标记物中应尽量 不含有或少含有游离的（未结合的）酶或 游离的抗体（或抗原）。此外酶标记物还 要有良好的稳定性。 在ELISA中，常用的酶为辣根过氧化 物酶(horseradish peroxidase, HRP)和 碱性磷酸酶(alkaline phosohatase, AP)
ELISA常用测定方法主要直接法和间接法。 直接法是酶标记抗体与待检测样本中固相抗 原直接作用，加入底物后，显色，其颜色 深浅与样本中抗原量成正比；
间接法是使已知抗原吸附在固相载体上，与 待检测样本中的抗体作用，加入酶底物， 显色，颜色深浅与样本中抗体量成正比。
ELISA大致分为三类： （1）测定抗体的间接法。 （2）测定抗原的双抗体夹心法。 （3）测定抗原的竞争法。
加入底物后，底物被酶催化变为有色产 物，产物的量与标本中受检物质的量直接相 关，故可根据颜色反应的深浅进行定性或定 量分析。（显色反应）
ELISA基本原理图示 ELISA基本原理图示
将抗原或抗体 固定于合适的 载体上，并保 持其生物活性 使抗原或抗 体与某种酶 连接，形成 酶标抗原或 抗体 待测样品与 酶标抗原或 抗体反应 加入酶反应底 物，复合物上 的酶催化底物 使其分解，氧 化或还原成有 色产物
酶联免疫吸附试验测定法和其他免疫 方法一样，都是以抗体和抗原的特异性结 合为基础，其差别在于酶联免疫方法以酶 或者辅酶作为标记物来标记抗原或抗体， 用酶促反应的放大作用来显示初级免疫学 反应。 其最大的特点是利用聚苯乙烯微量反 应板（或球）吸附抗原或者抗体使之固相 化，在其中进行免疫反应和酶促反应。
双抗体夹心法
非竞争结合反应 常用于抗原的检测 适用于分子中具有至少两个抗原决定簇的多 价抗原， 价抗原，而不能用于小分子半抗原的检测 所用两种抗体分别针对同一个抗原分子的不 同抗原决定簇
Sandwich ELISA
A less-common variant of this technique, called "sandwich" ELISA, is used to detect sample antigen. The steps are as follows: 1. Prepare a surface to which a known quantity of capture antibody is bound. 2. Block any non specific binding sites on the surface. 3. Apply the antigen-containing sample to the plate. 4. Wash the plate, so that unbound antigen is removed. 5. Apply enzyme linked primary antibodies as detection antibodies which also bind specifically to the antigen. 6. Wash the plate, so that the unbound antibody-enzyme conjugates are removed. 7. Apply a chemical which is converted by the enzyme into a color or fluorescent or electrochemical signal. 8. Measure the absorbency or fluorescence or electrochemical signal (e.g., current) of the plate wells to determine the presence and quantity of antigen.
洗涤的方法将固 相载体上的复合 物与其他物质分 离
ELISA试剂组成 ELISA试剂组成
完整的ELISA试剂盒应包含以下各组分： （1）已包被抗原或抗体的固相载体（免 疫吸附剂，俗称酶标板） （2）酶标记的抗原或抗体（酶标记物） （3）酶的底物 （4）系列参考标准品（定量测定） （5）酶标记物及样本的稀释液 （6）洗涤液 （7）反应终止液
4. 酶的底物 HRP的底物 常用的供氢体有邻苯二胺(OPD) 和四甲基联苯胺(TMB) 。 OPD氧化后的产物呈橙红色，用 酸终止酶反应后，在492nm处有最高 吸收峰，灵敏度高。 OPD见光易变质，与过氧化氢混 合成底物应用液后更不稳定，须现 配置现用。 先进的ELISA试剂盒中则直接配 成含保护剂的工作浓度为0.02% H2O2的应用液,只需加入OPD后即可 作为底物应用。
A sandwich ELISA. (1) Plate is coated with a capture antibody; (2) sample is added, and any antigen present binds to capture antibody; (3) enzyme linked capture antibody used as detecting antibody is added, and binds to antigen; (4) substrate is added, and is converted by enzyme to detectable form.
酶联免疫吸附试验(ELISA) 测定方法
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ELISA概述 ELISA基本原理 ELISA试剂的组成 ELISA测定方法 ELISA实验过程 ELISA在食品检测中的应用 ELISA在国外研究进展
ELISA概述 ELISA概述
enzyme-linked immunosorbent assay， ELISA ELISA属于标记免疫学技术的一种， 1971年由荷兰和瑞典的学者提出，由于其操 作过程简单易行并可以定量，从而使其在食 品安全和卫生检测中得到了广泛的应用。目 前市场上有多种基于ELISA方法开发的用于 食品中抗生素检测的试剂盒产品。
5. 洗涤液 洗涤液多为含非离子型洗涤剂的中性 缓冲液。聚苯乙烯载体与蛋白质的结合是 疏水性的，非离子型洗涤剂既含疏水基团 ，也含亲水基团，其疏水基团与蛋白质的 疏水基团借疏水键结合，从而削弱蛋白质 与固相载体的结合，并借助于亲水基团和 水分子的结合作用，使蛋白质回复到水溶 液状态，从而脱离固相载体。洗涤液中的 非离子型洗涤剂一般是吐温20，其浓度可 在0.05%-0.2%之间，高于0.2%时，可使包 被在固相上的抗原或抗体解吸附而减低试 验的灵敏度。