铅暴露TM4细胞中Nrf2对Mrp1表达的调节作用_王燕
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1 材料与方法
1.1 主要仪器与试剂 SW-CJ-1F 超净工作台（苏州 安泰空气技术有限公司），Synergy 2 多功能酶标仪（美 国 Biotek 公司），实时荧光定量 PCR 仪（美国 Applied Biosystems 公司），激光扫描共聚焦显微镜系统（德国 Leica 公司），Analyst800 型石墨炉原子吸光光谱仪（美 国 PE 公司）。
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环境与健康杂志 2014 年 2 月第 31 卷第 2 期 J Environ Health, February 2014, Vol．31, No．2
·基础与应用·
铅暴露 TM4 细胞中 Nrf2 对 Mrp1 表达的调节作用
王燕 1，2，余君 2，黄绍鑫 2，陈莉 2，汪春红 2
1.湖北中医药大学基础医学院，湖北 武汉 430065；2.武汉大学公共卫生学院卫生毒理学系
（antioxidant responsive element，ARE）信号通路调控下 游一系列相关基因的表达[1]，这包括一些抗氧化酶、Ⅱ 相解毒酶、药物外排泵等的调节。多药耐药蛋白 1 （multidrug resistance protein 1，MRP1） 是一个 ATP 依 赖的外排泵，被视为有代表性的谷胱甘肽-S-共轭外 排泵，能够向细胞外输送多种物质[2]。有研究表明，每
Wuhan，Hubei 430065，China Corresponding author：WANG Chun-hong，E-mail：wchunhong027@whu.edu.cn Abstract：Objective To explore the regulatory role of multidrug resistance protein 1 (Mrp1) by nuclear factor E2-related factor 2 (Nrf2) in TM4 cells exposed to lead. Methods TM4 cells in logarithmic growth phase were exposed to 20 μmol/L lead acetate (the control) and 10，20，40 and 80 μmol/L tert-butyl hydroquinone (tBHQ)+20 μmol/L lead acetate and 1，2，4 and 8 μmol/L all-trans retinoic acid (ATRA) +20 μmol/L of lead acetate, cultured for 24 h, and CCK-8 assay was used to examine the cell viability. TM4 cells were exposed to 0 (the control), 20 μmol/L lead acetate, 20 μmol/L lead acetate+40 μmol/L tBHQ, 20 μmol/L lead acetate +2 μmol/L ATRA medium to culture for 24 h. Pb2 + content was determined by atomic absorption spectrometry，the expressions of Nrf2 and Mrp1 were detected by reverse quantitative PCR (qRT-PCR)，and the localization of Nrf2 was examined by immunofluorescence. Results As the tBHQ, ATRA exposure concentration increased, TM4 cell viability in lead exposure group showed a downward trend after the first rising; Compared with the control group, TM4 cell viability were significantly lower in 80 μmol/L tBHQ+20 μmol/L lead acetate group and 8 μmol/L ATRA+20 μmol/L lead acetate group (P< 0.05). Compared with the control group，the expressions of Nrf2 mRNA and Mrp1 mRNA and Pb2+ content of TM4 cells in the lead acetate group, lead acetate+tBHQ group，lead acetate+TARA group significantly increased (P<0.05); Compared with the lead acetate group, the expressions of Nrf2 mRNA of TM4 cells in the lead acetate+tBHQ group and Pb2+ content of TM4 cells in the lead acetate+TARA group TM4 cells increased, but the expressions of Mrp1 mRNA of TM4 cells in lead acetate+TARA group significantly decreased (P<0.05). Conclusion Nrf2 may be involved in the up-regulated expression of Mrp1 in TM4 cells exposed to lead. Key words：Lead；Testicular；Nuclear factor E2-related factor 2 (Nrf2)；multidrug resistance protein 1 (Mrp1)
环境与健康杂志 2014 年 2 月第 31 卷第 2 期 J Environபைடு நூலகம்Health, February 2014, Vol．31, No．2
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一个有机体都有其自身的防御系统，某些重金属（如 汞、镉等）可以通过 Mrp1 实现自身机体的自我解毒防 御作用，与 Nrf2 的激活有一定关系[3-4]。目前，关于铅对 男性生殖系统睾丸毒性的作用机制仍不十分清楚，而 在铅中毒防治过程中常规使用药物又因其副作用而 受到不少质疑，因而进一步积极寻找有效的排铅途径 意义重大。本课题组前期研究表明，铅染毒大鼠睾丸 组织中 Nrf2 与 Mrp1 的表达变化呈现一致性[5]。叔丁基 对苯二酚（tBHQ）是一种小分子的 Nrf2 特异性的激活 剂[6]，可以增加 Nrf2 的稳定性，活化 Nrf2，继而通过 Nrf2-ARE 信号通路调节其下游基因的表达。全反视 黄酸 （ATRA） 是 Nrf2 的抑制剂，通过识别转录因子 Nrf2 的视黄酸受体而发挥功能，能够抑制 Nrf2 与 ARE 的结合[7]。本研究进一步通过体外实验，对铅染毒 小鼠睾丸支持细胞（TM4 细胞）分别应用 Nrf2 激活剂 tBHQ 与抑制剂 ATRA 处理，探讨铅染毒 TM4 细胞中 Nrf2 对 Mrp1 表达的调节作用，为探寻细胞的自身防 御机制与有效的细胞解毒方法提供实验依据。
摘要：目的 探讨铅暴露小鼠睾丸支持细胞（TM4 细胞）核因子 E2 相关因子 2（nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2）对多 药耐药蛋白 1（multidrug resistance protein 1，Mrp1）表达的调节作用。方法 将处于对数生长期的 TM4 细胞分别暴露于含 20 μmol/L 乙酸铅（对照）和 10、20、40、80 μmol/L 叔丁基对苯二酚（tBHQ，Nrf2 激活剂）+20 μmol/L 乙酸铅及含 1、2、4、 8 μmol/L 全反视黄酸（ATRA，Nrf2 抑制剂）+20 μmol/L 乙酸铅的培养基培养 24 h，采用 CCK-8 法检测细胞的存活率。将 TM4 细胞分别暴露于含 0 （对照）、20 μmol/L 乙酸铅、20 μmol/L 乙酸铅+40 μmol/L tBHQ、20 μmol/L 乙酸铅+2 μmol/L ATRA 继续培养 24 h。采用原子吸收光谱法测定细胞铅含量，采用实时荧光定量 PCR （qRT-PCR） 检测 Nrf2 与 Mrp1 mRNA 的表达水平，细胞免疫荧光法观察细胞中 Nrf2 的分布定位情况。结果 随着 tBHQ、ATRA 暴露浓度的升高，铅暴 露 TM4 细胞的存活率均呈先上升后下降的趋势。与对照组比较，80 μmol/L tBHQ+20 μmol/L 乙酸铅组及 8 μmol/L ATRA+ 20 μmol/L 乙酸铅组 TM4 细胞的存活率均较低，差异有统计学意义（P<0.05）。与对照组相比，乙酸铅组、乙酸铅+tBHQ 组、 乙酸铅+TARA 组 TM4 细胞中的 Nrf2 与 Mrp1 mRNA 表达及铅含量均较高，差异有统计学意义（P<0.05）；与铅暴露组比 较，乙酸铅+tBHQ 组 TM4 细胞中的 Nrf2 mRNA 表达及乙酸铅+TARA 组 TM4 细胞中的铅含量均较高，而乙酸铅+TARA 组 TM4 细胞中的 Mrp1 mRNA 表达较低，差异有统计学意义（P<0.05）。各处理组中 Nrf2 均未见明显核转位改变。结论 铅暴露 TM4 细胞可以通过 Nrf2 的激活上调 Mrp1 的表达。 关键词：铅；睾丸；核因子 E2 相关因子 2；多药耐药蛋白 1 中图分类号：R994.6 文献标志码：A 文章编号：1001-5914（2014）02-0114-04
Regulation of Mrp1 expression by Nrf2 in TM4 cells exposed to lead
WANG Yan*，YU Jun，HUANG Shao-xin，CHEN Li，WANG Chun-hong *Department of Preventive Medicine,College of Basic Medical Sciences,Hubei University of Chinese Medicine，
乙酸铅（分析纯，上海试四赫维化工有限公司），马 血清（上海 Gibco 公司），DMEM/F12（美国 Hyclone 公 司），叔丁基对苯二酚（tert-butylhydroquinone，tBHQ，美 国 Sigma 公司），反式视黄酸 （all-trans-retinoic acid， ATRA，美国 Sigma 公司），CCK-8 试剂盒（碧云天生物 技术公司），qRT-PCR 引物（上海生物工程技术有限公 司），兔抗小鼠 Nrf2 多克隆一抗（北京博奥森生物技术 有限公司），异硫氰酸荧光素（fluoresceinisothiocyanate， FITC）标记的山羊抗兔二抗（北京博奥森生物技术有 限 公 司），cDNA 第 一 链 合 成 （easyscript first -strand cDNA synthesis）试剂盒（北京全式金生物技术有限公 司），iTaqTM Universal SYBRR Green Supermix 试剂盒（美 国 BIO-RAD 公司）。
核因子 E2 相关因子 2 （nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2） 是细胞内重要的氧化应激反应调节因 子 ， 活 化 的 Nrf2 可 通 过 Nrf2 - 抗 氧 化 反 应 元 件
基金项目：国家自然科学基金（81172628） 作者简介：王燕（1980-），女，讲师，博士，从事卫生毒理学研究。 通讯作者：汪春红，E-mail：wchunhong027@whu.edu.cn
1.1 主要仪器与试剂 SW-CJ-1F 超净工作台（苏州 安泰空气技术有限公司），Synergy 2 多功能酶标仪（美 国 Biotek 公司），实时荧光定量 PCR 仪（美国 Applied Biosystems 公司），激光扫描共聚焦显微镜系统（德国 Leica 公司），Analyst800 型石墨炉原子吸光光谱仪（美 国 PE 公司）。
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·基础与应用·
铅暴露 TM4 细胞中 Nrf2 对 Mrp1 表达的调节作用
王燕 1，2，余君 2，黄绍鑫 2，陈莉 2，汪春红 2
1.湖北中医药大学基础医学院，湖北 武汉 430065；2.武汉大学公共卫生学院卫生毒理学系
（antioxidant responsive element，ARE）信号通路调控下 游一系列相关基因的表达[1]，这包括一些抗氧化酶、Ⅱ 相解毒酶、药物外排泵等的调节。多药耐药蛋白 1 （multidrug resistance protein 1，MRP1） 是一个 ATP 依 赖的外排泵，被视为有代表性的谷胱甘肽-S-共轭外 排泵，能够向细胞外输送多种物质[2]。有研究表明，每
Wuhan，Hubei 430065，China Corresponding author：WANG Chun-hong，E-mail：wchunhong027@whu.edu.cn Abstract：Objective To explore the regulatory role of multidrug resistance protein 1 (Mrp1) by nuclear factor E2-related factor 2 (Nrf2) in TM4 cells exposed to lead. Methods TM4 cells in logarithmic growth phase were exposed to 20 μmol/L lead acetate (the control) and 10，20，40 and 80 μmol/L tert-butyl hydroquinone (tBHQ)+20 μmol/L lead acetate and 1，2，4 and 8 μmol/L all-trans retinoic acid (ATRA) +20 μmol/L of lead acetate, cultured for 24 h, and CCK-8 assay was used to examine the cell viability. TM4 cells were exposed to 0 (the control), 20 μmol/L lead acetate, 20 μmol/L lead acetate+40 μmol/L tBHQ, 20 μmol/L lead acetate +2 μmol/L ATRA medium to culture for 24 h. Pb2 + content was determined by atomic absorption spectrometry，the expressions of Nrf2 and Mrp1 were detected by reverse quantitative PCR (qRT-PCR)，and the localization of Nrf2 was examined by immunofluorescence. Results As the tBHQ, ATRA exposure concentration increased, TM4 cell viability in lead exposure group showed a downward trend after the first rising; Compared with the control group, TM4 cell viability were significantly lower in 80 μmol/L tBHQ+20 μmol/L lead acetate group and 8 μmol/L ATRA+20 μmol/L lead acetate group (P< 0.05). Compared with the control group，the expressions of Nrf2 mRNA and Mrp1 mRNA and Pb2+ content of TM4 cells in the lead acetate group, lead acetate+tBHQ group，lead acetate+TARA group significantly increased (P<0.05); Compared with the lead acetate group, the expressions of Nrf2 mRNA of TM4 cells in the lead acetate+tBHQ group and Pb2+ content of TM4 cells in the lead acetate+TARA group TM4 cells increased, but the expressions of Mrp1 mRNA of TM4 cells in lead acetate+TARA group significantly decreased (P<0.05). Conclusion Nrf2 may be involved in the up-regulated expression of Mrp1 in TM4 cells exposed to lead. Key words：Lead；Testicular；Nuclear factor E2-related factor 2 (Nrf2)；multidrug resistance protein 1 (Mrp1)
环境与健康杂志 2014 年 2 月第 31 卷第 2 期 J Environபைடு நூலகம்Health, February 2014, Vol．31, No．2
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一个有机体都有其自身的防御系统，某些重金属（如 汞、镉等）可以通过 Mrp1 实现自身机体的自我解毒防 御作用，与 Nrf2 的激活有一定关系[3-4]。目前，关于铅对 男性生殖系统睾丸毒性的作用机制仍不十分清楚，而 在铅中毒防治过程中常规使用药物又因其副作用而 受到不少质疑，因而进一步积极寻找有效的排铅途径 意义重大。本课题组前期研究表明，铅染毒大鼠睾丸 组织中 Nrf2 与 Mrp1 的表达变化呈现一致性[5]。叔丁基 对苯二酚（tBHQ）是一种小分子的 Nrf2 特异性的激活 剂[6]，可以增加 Nrf2 的稳定性，活化 Nrf2，继而通过 Nrf2-ARE 信号通路调节其下游基因的表达。全反视 黄酸 （ATRA） 是 Nrf2 的抑制剂，通过识别转录因子 Nrf2 的视黄酸受体而发挥功能，能够抑制 Nrf2 与 ARE 的结合[7]。本研究进一步通过体外实验，对铅染毒 小鼠睾丸支持细胞（TM4 细胞）分别应用 Nrf2 激活剂 tBHQ 与抑制剂 ATRA 处理，探讨铅染毒 TM4 细胞中 Nrf2 对 Mrp1 表达的调节作用，为探寻细胞的自身防 御机制与有效的细胞解毒方法提供实验依据。
摘要：目的 探讨铅暴露小鼠睾丸支持细胞（TM4 细胞）核因子 E2 相关因子 2（nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2）对多 药耐药蛋白 1（multidrug resistance protein 1，Mrp1）表达的调节作用。方法 将处于对数生长期的 TM4 细胞分别暴露于含 20 μmol/L 乙酸铅（对照）和 10、20、40、80 μmol/L 叔丁基对苯二酚（tBHQ，Nrf2 激活剂）+20 μmol/L 乙酸铅及含 1、2、4、 8 μmol/L 全反视黄酸（ATRA，Nrf2 抑制剂）+20 μmol/L 乙酸铅的培养基培养 24 h，采用 CCK-8 法检测细胞的存活率。将 TM4 细胞分别暴露于含 0 （对照）、20 μmol/L 乙酸铅、20 μmol/L 乙酸铅+40 μmol/L tBHQ、20 μmol/L 乙酸铅+2 μmol/L ATRA 继续培养 24 h。采用原子吸收光谱法测定细胞铅含量，采用实时荧光定量 PCR （qRT-PCR） 检测 Nrf2 与 Mrp1 mRNA 的表达水平，细胞免疫荧光法观察细胞中 Nrf2 的分布定位情况。结果 随着 tBHQ、ATRA 暴露浓度的升高，铅暴 露 TM4 细胞的存活率均呈先上升后下降的趋势。与对照组比较，80 μmol/L tBHQ+20 μmol/L 乙酸铅组及 8 μmol/L ATRA+ 20 μmol/L 乙酸铅组 TM4 细胞的存活率均较低，差异有统计学意义（P<0.05）。与对照组相比，乙酸铅组、乙酸铅+tBHQ 组、 乙酸铅+TARA 组 TM4 细胞中的 Nrf2 与 Mrp1 mRNA 表达及铅含量均较高，差异有统计学意义（P<0.05）；与铅暴露组比 较，乙酸铅+tBHQ 组 TM4 细胞中的 Nrf2 mRNA 表达及乙酸铅+TARA 组 TM4 细胞中的铅含量均较高，而乙酸铅+TARA 组 TM4 细胞中的 Mrp1 mRNA 表达较低，差异有统计学意义（P<0.05）。各处理组中 Nrf2 均未见明显核转位改变。结论 铅暴露 TM4 细胞可以通过 Nrf2 的激活上调 Mrp1 的表达。 关键词：铅；睾丸；核因子 E2 相关因子 2；多药耐药蛋白 1 中图分类号：R994.6 文献标志码：A 文章编号：1001-5914（2014）02-0114-04
Regulation of Mrp1 expression by Nrf2 in TM4 cells exposed to lead
WANG Yan*，YU Jun，HUANG Shao-xin，CHEN Li，WANG Chun-hong *Department of Preventive Medicine,College of Basic Medical Sciences,Hubei University of Chinese Medicine，
乙酸铅（分析纯，上海试四赫维化工有限公司），马 血清（上海 Gibco 公司），DMEM/F12（美国 Hyclone 公 司），叔丁基对苯二酚（tert-butylhydroquinone，tBHQ，美 国 Sigma 公司），反式视黄酸 （all-trans-retinoic acid， ATRA，美国 Sigma 公司），CCK-8 试剂盒（碧云天生物 技术公司），qRT-PCR 引物（上海生物工程技术有限公 司），兔抗小鼠 Nrf2 多克隆一抗（北京博奥森生物技术 有限公司），异硫氰酸荧光素（fluoresceinisothiocyanate， FITC）标记的山羊抗兔二抗（北京博奥森生物技术有 限 公 司），cDNA 第 一 链 合 成 （easyscript first -strand cDNA synthesis）试剂盒（北京全式金生物技术有限公 司），iTaqTM Universal SYBRR Green Supermix 试剂盒（美 国 BIO-RAD 公司）。
核因子 E2 相关因子 2 （nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2） 是细胞内重要的氧化应激反应调节因 子 ， 活 化 的 Nrf2 可 通 过 Nrf2 - 抗 氧 化 反 应 元 件
基金项目：国家自然科学基金（81172628） 作者简介：王燕（1980-），女，讲师，博士，从事卫生毒理学研究。 通讯作者：汪春红，E-mail：wchunhong027@whu.edu.cn