粮油食品中真菌毒素的LCMS法检测

收稿日期：２００６－１２－１２

作者简介：罗松明（１９７７－），男，四川南充人，硕士，助教，主要从事粮

油食品加工与质量安全方面的教学与科研工作。

真菌（Ｆｕｎｇｉ）是一类有细胞壁、不含叶绿素、无根叶茎、以腐生或寄生方式生存、能进行有性或无性繁殖的微生物。真菌毒素（ｍｙｃｏｔｏｘｉｎ）是真菌产生的次级代谢产物，目前已知有３００多种。其中对人类危害最大、人类也研究最多的真菌毒素主要有：黄曲霉毒素，主要是黄曲霉毒素Ｂ１和Ｍ１（ａｆｌａｔｏｘｉｎｓ，

ＡＦＢ１、ＡＦＭ１）；赭（棕）曲霉毒素Ａ（ｏｃｈｒａｔｏｘｉｎＡ，Ｏ－ＴＡ）；杂色（柄）曲霉毒素（ｓｔｅｒｉｇｍａｔｏｃｙｓｔｉｎ）；展青霉毒素（ｐａｔｕｌｉｎ，ＰＴＬ）；黄绿青霉毒素（ｃｉｔｒｅｏｖｉｒｉｄｉｎｅｔｏｘ－ｉｎ，ＣＩＴ）；玉米赤霉烯酮（ｚｅａｒａｌｅｎｏｎｅ，ＺＥＡ（Ｆ－２））；串珠镰刀菌毒素（ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｎ，ＭＦ）三硝基丙酸以及属于

单端孢霉烯族化合物（ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｅｎｅｓ）的Ｔ－２毒素（Ｔ－２ｔｏｘｉｎ，Ｔ－２）；脱氧雪腐镰刀菌烯醇（呕吐毒素）（ｄｅｏｘｙｎｉｖａｌｅｎｏｌ，ＤＯＮ）；二乙酰镳草镰刀菌烯醇（ｄｉ－

ａｃｅｔｏｘｙｓｃｉｒｐｅｎｏｌ，ＤＡＳ）；麦角胺（ｅｒｇｏｔａｍｉｎｅ）；细交链

孢菌酮酸（ｔｅｎｕａｚｏｎｉｃａｃｉｄ）等［１］。这些真菌毒素不仅可以污染食品引起食物中毒，而且有些还具有致癌、致畸、致突变作用，对人类健康造成极大威胁。

１ＬＣ－ＭＳ联用

目前检测真菌毒素的国标方法主要以薄层色谱

法、酶联免疫法为主。近年来，气相色谱法、高效液相色谱法已经成为现代仪器分析的应用最为广泛的方法。而色谱－质谱联用技术结合了色谱、质谱两者的优点，已经成为仪器分析进展的热点。液相色谱（ＬＣ）可以直接分析不挥发性化合物、极性化合物和大分子化合物（包括蛋白质、脂肪、多糖及多聚物等），分析范围广，而且不需衍生化步骤。质谱（ＭＳ）作为理想的色谱检测器，不仅特异，而且具有极高的检测灵敏度。因此ＬＣ－ＭＳ联用长期为人们所关注。

粮油食品中真菌毒素的ＬＣ－ＭＳ法检测

罗松明１，肖付刚２

（１．四川农业大学工学院食品科学系，四川雅安６２５０１４；２．江南大学食品学院，江苏无锡２１４０３６）

摘要：粮油食品中常见的真菌毒素有：黄曲霉毒素、赭（棕）曲霉毒素、展青霉毒素、玉米赤霉烯酮、串珠镰刀

菌毒素及脱氧雪腐镰刀菌烯醇等，因含量较低，用常规方法检测不出来。用ＬＣ－ＭＳ检测，灵敏度高、前处理比较简单，结果准确可靠，在检测食品中真菌毒素上前景广阔。

关键词：液－质联用；真菌毒素；ＬＣ－ＭＳ检测法中图分类号：ＴＳ２０７．５

文献标识码：Ａ

文章编号：１００７－６３９５（２００７）０３－００９５－０４

ＬＣ－ＭＳ检测主要分３步：提取，净化，上机分

析。提取试剂一般用有机溶剂。可供选择的净化柱有填充硅镁吸附剂或硅胶的固相萃取柱（ｓｏｌｉｄｐｈａｓｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ，ＳＰＥ）、

免疫亲和柱（ｉｍｍｕｎｏａｆｆｉｎｉｔｙｃｏｌｕｍｎ，ＩＡＣ）、多功能净化柱（ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎｃｌｅａｎｕｐｃｏｌｕｍｎ，ＭＦＣ）［２］。

２ＬＣ－ＭＳ在检测食品中真菌毒素中的应用２．１黄曲霉毒素的检测

黄曲霉毒素（ＡＦ）是由黄曲霉（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｆｌａｖｕｓ）和寄生曲霉（Ａｐａｒａｓｉｔｉｃｓ）所产生的１组毒性代谢产物。目前已分离出２０多种，根据它们在紫外光下发出的荧光颜色分为２大族，即Ｂ族和Ｇ族。ＡＦＢ１、ＡＦＢ２、ＡＦＧ１和ＡＦＧ２是４种基本的黄曲霉毒素，其余均为衍生物。从化学结构上看，所有ＡＦ具有相同

的基本结构，它包括１个双呋喃环和１个氧杂酮，前者为毒性结构，后者具有加强毒性及致癌作用。其中

ＡＦＢ１被公认为是目前致癌力最强的天然物质。ＡＦ

常常存在于土壤、动植物及各种坚果中，特别是花生和核桃中，在大豆、玉米、奶制品及食用油等制品中也经常发现ＡＦ。各国大都制定了相关法律来限定其在食品中的含量。例如，欧盟国家规定，要求人类生活消费品中的ＡＦＢ１的含量不能超过２μｇ／ｋｇ，总量不能超过４μｇ／ｋｇ；牛奶和奶制品中的含量不能超过

０．０５μｇ／ｋｇ［３］。中国也制定了ＡＦＢ１限量标准。

林建忠等［４］用ＬＣ－ＭＳ测定食品中的ＡＦＢ１。使用

ＡＰＩ３０００三级四极杆质谱系统和Ａｇｉｌｅｎｔ液相系统（Ａｇｉｌｅｎｔ１１００）。色谱柱为ＥＣＮｕｃｅｏｄｕｒ１００－５Ｃ１８柱（２５０ｍｍ×４．６ｍｍ）；流动相：１０ｍｍｏｌ／Ｌ，乙酸铵︰甲醇的体积比３︰７；流速：８００μＬ／ｍｉｎ。质谱采用ＥＳＩ源，正离子反应监测模式，前级离子ｍ／ｚ＝３１３．０，二级

离子ｍ／ｚ＝２８５．３。样品经ＡＦ免疫亲和柱纯化后用

ＬＣ／ＭＳ进行测定。质谱系统稳定的情况下，可在１ｈ之内检测大部分食品中的ＡＦＢ１并给出灵敏可靠的结果。本法在添加０．５０￣５．０μｇ／ｋｇ的ＡＦＢ１时回收率为６０％～９０％，相对标准偏差为９．６２％，检测限达０．０５μｇ／ｋｇ，可满足欧盟最新限量要求。

Ｖｅｎｔｕｒａ等［５］建立了１种简便的测定Ｒｈａｍｍｕｓｐｕｒｓｈｉａｎａ中黄曲霉毒素Ｂ１、Ｇ１、Ｂ２、Ｇ２的ＬＣ－ＭＳ方法。用甲醇－水混合物提取样品中的ＡＦ，然后用装有聚合物吸附剂的固相萃取柱进行净化。净化液直接进样，色谱系统装有Ｃ１８反相短柱，使用甲醇－水的体积比３０︰７０作流动相；质谱系统是单级四极杆质谱，带电喷雾电离源，使用阳离子模式。结果显示有较好的重复性，ＡＦＢ１、ＡＦＢ２、ＡＦＧ１、ＡＦＧ２的回收率分别为１００％、８９％、８１％、７７％。Ｓ／Ｎ＝３时检测限达１０ｎｇ，Ｓ／Ｎ＝１０时检测限为２５ｎｇ。

２．２赭曲霉毒素的检测

赭曲霉毒素（ＯＴ）是赭色曲霉属和几种青霉属真菌产生的一种毒素，包括Ａ、Ｂ、Ｃ等７种结构类似的化合物，其中以ＯＴＡ毒性最大。赭色曲霉属产生ＯＴ的条件是中温、寒冷气候。一般容易感染ＯＴ的食品包括大豆、绿豆、绿咖啡豆、啤酒、葡萄汁、调味品及草本植物。ＯＴ对动物的肝脏和肾脏危害最大，而且还有致畸性、免疫抑制和致癌性。欧盟国家对ＯＴＡ在食品中的限量标准极其严格，如：在谷物中不得超过５μｇ／ｋｇ；在谷物制品中不得超过３μｇ／ｋｇ，在干鲜果品中不得超过１０μｇ／ｋｇ［６，７］。

Ｍｉｃｈａｅｌ等人［８］用ＬＣ－ＭＳ测定谷类制品中的Ｏ－ＴＡ。先对受试样品进行溶剂提取，提取液用免疫亲和柱净化，然后上机进行分析检测。结果显示，检测限为１５μｇ／ｋｇ，回收率为９０％。

２．３展青霉毒素的检测

展青霉毒素（ＰＴＬ）又名棒曲霉毒素，可由多种青霉及曲霉产生，它是１种神经毒素，有致畸性和致癌性，主要污染水果、浆果、蔬菜、面包和肉类制品。ＰＴＬ能诱发肿瘤，并对消化系统和皮肤组织具有损害作用［９］。

Ｓｅｗｒａｍ等人［１０］用配备有选择性反应检测器（ＳＲＭ）的ＬＣ－ＭＳ－ＭＳ来检测苹果汁中的ＰＴＬ。实验条件如下：

ＨＰＬＣ条件：流动相：乙腈－水的体积比１０︰９０，Ｃ１８反相柱（填充５μｍＯＤＳ－２），进样量２０μＬ，流速０．５ｍＬ／ｍｉｎ，在ＭＳ检测之前先用ＵＶ在２７６ｎｍ进行在线检测。

ＭＳ条件：使用大气压化学电离－质谱（ＡＰＣＩ–ＭＳ），ＡＰＣＩ气化温度和质谱毛细管柱温分别为４５０℃和１５０℃，离子流和柱压分别为５μＡ和７Ｖ或－４Ｖ（阳离子或阴离子）。质谱进行ｍ／ｚ１００￣ｍ／ｚ１６０全扫描以观察质子化的（ｍ／ｚ１５５）或去质子化（ｍ／ｚ１５３）的分子离子。

ＰＴＬ的检测是对去质子化的分子离子进行碰撞诱导分裂（１５％碰撞能量），利用选择反应检测（ＳＲＭ）通过ＭＳ－ＭＳ模式完成。ｍ／ｚ１３５、１２５和１０９的最终离子用分离宽２ｕ检测，通过与标准品的峰面积比较定量。当注射量在６￣２００ｎｇ范围时，ＰＴＬ和注射量呈线性，使用阴离子效果较好。感染１０￣１３５μｇ／ＬＰＴＬ的苹果汁在用乙酸乙酯液液萃取和碳酸钠处理后用反相ＨＰＬＣ分析，使用乙腈－水的体积比１０︰９０、流速０．５ｍＬ／ｍｉｎ，可以检测到１０μｇ／Ｌ，当信噪比（Ｓ／Ｎ）为４时，检测限为４μｇ／Ｌ。

Ｔｈｏｍａｓ等［１１］使用ＨＰＬＣ－ＡＰＣＩ－ＭＳ来检测肉及水果中的ＰＴＬ，回收率为８７％￣１１６％，检出限达到６ｎｇ／ｇ。

２．４串珠镰刀菌毒素的检测

串珠镰刀菌毒素（ＭＦ）属剧毒物，有很强的心脏毒性，中毒死亡后可见心肌坏死性病变，近年研究表明该毒素可能是克山病主因。ＭＦ广泛污染粮食作物，其中对玉米及玉米制品的污染率较高［１２］。

Ｓｅｗｒａｍ等［１３］以三乙胺作为离子对试剂应用ＬＣ－ＭＳ测定镰刀菌毒素培养基中的ＭＦ与自然污染的玉米中的ＭＦ。

ＨＰＬＣ分析中使用ＳｐｅｃｔｒａＳｅｒｉｅｓＰ２０００泵并联有ＡＳ１０００自动进样器，ＵＶ１０００可变波长紫外检测器，１５０ｍｍ×２ｍｍＣ１８反相色谱柱（填充有５ｍＯＤＳ－２）。流动相：醋酸铵－甲醇－三乙胺的体积比９０︰１０︰０．１，ｐＨ８．２４，流速０．５ｍＬ／ｍｉｎ。样品过０．４５μｍ微孔滤膜，进样量为２０μＬ。２２９ｎｍ为紫外检测限。

负离子ＡＰＣＩ－ＭＳ中应用ＦｉｎｎｉｇａｎＭＡＴＬＣＱ离子阱质谱。直接以５μＬ／ｍｉｎ的流速将３０μｇ／ｍＬＭＦ标样混入样品、混和进样以优化ＭＳ参数。ＡＰＣＩ气化温度和质谱毛细管柱温为３５０℃和１５０℃。电流保持在５μＡ，电压保持在８Ｖ。调整期间，质谱从ｍ／ｚ５０扫描至ｍ／ｚ１５０，之后的所有实验都是在ＳＩＭ模式ｍ／ｚ９７监测去质子分子离子［Ｍ－Ｈ］－下完成的。

５种南非产的Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｕｂｇｌｕｔｉｎａｎｓ菌株在玉米颗粒上培养，用９５︰５的乙腈水溶液提取ＭＦ。过Ｃ１８反相固相萃取柱，萃取液上ＬＣ－ＭＳ分析。研究发现ＭＦ的响应在进样量１０ｎｇ￣７００ｎｇ之间保持线