石油—重金属复合污染土壤的微生物修复

石油—重金属复合污染土壤的微生物修复
摘要：以盐碱土为供试土壤，分别加入5个浓度的重金属Cd2+（2.5，5，10，15，20 mg/kg）或Ni（25，50，100，150，200 mg/kg），分别添加2 000 mg/kg 石油烃，将加入石油降解菌的试验组与不加菌的对照组进行对比，研究石油-重金属复合污染土壤微生物修复过程中重金属有效态和形态的变化规律。

结果表明，石油-重金属复合污染盐碱土的微生物修复过程中，土壤中有效态Cd2+、Ni 随培养时间增长，有效态含量呈起伏变化，且土壤中有效态Cd2+与Ni的变化规律存在明显不同。

培养60 d后，土壤中Cd2+的可氧化态含量均下降，可还原态含量均略有增加，低浓度时弱酸提取态Cd2+含量降低，残渣态Cd2+含量增加，高浓度时变化趋势相反。

培养60 d后，Ni的弱酸提取态、可还原态、可氧化态3种形态总量呈下降趋势，残渣态Ni含量则增加，Ni的形态分布由不稳定向稳定方向迁移，活性降低。

关键词：重金属有效态；形态分布；微生物修复；复合污染；盐碱土
Microbial Remediation of Petroleum-Heavy Metals Contaminated Soil
Abstract：The contaminated saline-alkali soil was prepared by adding appropriate concentrations of CdCl2（2.5，5，10，15，20 mg/kg）and NiCl2（25，50，100，150，200 mg/kg）firstly. After the metal-treated soil was incubated for two months，2 000 mg/kg of petroleum was added. Test group of adding petroleum degrading sgtains and test group without such strains were compared，the change pattern of availability and form of heavy metals during microbial rernediation process in petroleum-heavy metals comtarminated soil. The results indicated that the availability of soil Cd and Ni both had a tendency of alternately fluctuanting change with the elapsing of time. But，their change law was proved significantly different. The content of oxidizable Cd decreased while the content of reducible Cd increased after 60 days of cultivation. At low concentrations of soil Cd2+，the content of acetic acid extractable Cd decreased while the content of residual Cd increased. However，it showed a contrary tendency at high concentrations of Cd2+. The total amount of the acetic acid extractable，oxidizable and reducible Ni all decreased while the content of residual Ni increased after cultivation for 60 days. As a result，the form distribution of Ni tended from the stable to the unstable state with the reduction of active Ni.
Key words：availabiliy of heavy metals；species distribution；microbial remediation；composite pollution；saline-alkali soil
长期以来，环境工作者仅限于单一污染物在自然环境中的迁移转化、归趋及生态效应的研究[1]。

随着工业的快速发展和科学技术的不断创新，人们逐渐认识到环境污染物多具有伴生性和综合性[2，3]，即不同污染物之间会产生联合作
用，形成复合污染。

国外研究结果表明，石油中可检测出Ni、V、Fe等56种微量金属元素，石油勘探和开采、原油泄漏等原因会导致大量重金属进入土壤环境，土壤石油污染可能会伴生土壤重金属污染[4-6]。

Chukwujindu[7]研究发现，在尼日利亚尼日尔河三角洲石油污染土壤上可检测到大量重金属Zn、Cu、Pb、Cd、Ni、Cr、Mn。

邵涛等[8]对江苏某油区已开采多年的未耕土壤研究表明石油污染土壤中总As、Pb、Cr等都有不同程度的污染。

因此，油田区石油-重金属复合污染土壤的研究及修复，已成为亟待解决的问题。

由于成本低、易操作、作用持久等，微生物修复石油污染土壤已成为研究和应用热点[9-12]。

众所周知，石油烃在土壤中的代谢中间产物是很复杂的，而现有的文献报道，有机物对重金属环境行为的影响十分复杂，高分子有机物通过络合或螯合、吸附、截留等作用，钝化土壤中重金属；低分子有机物通过螯合、络合作用活化土壤中重金属，重金属以不同形态存在关系到在石油-重金属复合污染土壤修复过程中微生物的降解效率以及是否需要增加辅助工程解决重金属污染等问题，因此石油-重金属复合污染土壤修复过程中就必须考虑重金属有效态及形态的变化。

针对石油-重金属复合污染土壤修复过程中可能产生的次生污染问题展开研究，通过培养试验研究了石油-重金属复合污染土壤微生物修复过程中重金属Cd、Ni的有效态和形态变化，为复合污染土壤的修复提供理论指导。

1 材料与方法
1.1 供试土壤与供试材料
供试土壤采自山东省东营市孤岛油区的盐碱土，主要采集0～20 cm的表层土壤，经风干磨细过20目筛备用，土壤基本理化性质见表1。

土壤基本理化性质按常规方法测定[13]。

添加石油烃为原油，含水率为60%。

供试微生物由山东省科学院提供的耐盐碱并可降解石油的枯草芽孢杆菌和多食鞘氨醇杆菌。

1.2 研究方法
称取0.5 kg过20目筛风干土样于塑料盆中，选取Cd、Ni两种重金属，分别配置含Cd浓度为0、2.5、5.0、10.0、15.0、20.0 mg/kg和Ni 浓度为0、25、50、100、150、200 mg/kg的模拟污染土，在室内培养两个月后，备用。

因需考虑土著微生物对石油降解和重金属行为变化的影响，每个处理再设加菌与不加菌对照。

将石油烃溶解后加入土壤并充分混合，使石油烃浓度达到2 000 mg/kg，每钵施氮、磷、钾作基肥，试验组同时施加40 g/kg浓度的石油降解菌剂。

保持土壤含水率在50%～70%范围内[14]，以60 d为周期，每隔15 d采样测定重金属有效态的含量，并在起始及结束时测定土壤重金属形态，分析重金属形态变化特征。

1.3 分析方法
土壤中Cd、Ni有效态分析：DTPA（pH 7.3，液土比2∶1）浸提，原子吸收分光光度法测定重金属含量[15]。

土壤中Cd、Ni形态分析：采用欧洲共同体标准物质局提出的BCR法[16]，弱酸提取态用0.11 mol/L的醋酸提取；可还原态用0.1 mol/L的盐酸羟胺（HNO3酸化，pH 2）提取；可氧化态用8.8 mol/L的双氧水（HNO3酸化，pH 2）水浴氧化，然后用1 mol/L的醋酸铵（HNO3酸化，pH 2）提取；残渣态用10 mL HF+1 mL HClO4消煮，方法同全量测定[13]。

2 结果与分析
2.1 土壤中重金属有效态含量变化
由表2可知，不论加降解菌与否，土壤中有效态Cd含量随培养时间呈跌宕起伏变化，各处理组没有呈现明显的规律性，但几乎所有的处理组均在培养60 d 时，土壤有效态Cd含量达到最大值。

这可能一是土壤中Cd对微生物新陈代谢产生影响的同时，微生物也能够通过产生胞外聚合物、代谢产生有机酸等改变土壤中Cd的生物有效性；二是微生物菌体对重金属有一定的吸收作用。

这种跌宕起伏的曲线，可能和土壤中微生物生长曲线有一定的关系，此外，这里所研究的土壤为石油-重金属复合污染盐碱土，随着培养时间的增加，微生物对石油降解率增加，石油降解的中间产物可能会对重金属有一定的鳌合作用，也影响着土壤中Cd的生物有效性[17，18]。

从表2还可以看出，几乎所有添加降解菌的处理各培养时间土壤中有效态Cd含量均低于相应不加降解菌的处理。

可以进一步说明微生物对土壤中重金属有一定的固持作用。

当添加Cd浓度为20 mg/kg时，培养45 d后，添加降解菌的处理土壤中有效态Cd含量高于相应不加降解菌的处理，原因可能是微生物在高重金属浓度下失去活性。

由表3可知，不论加降解菌与否，土壤中重金属有效态Ni含量均随时间有较大的起伏。

土壤中Ni的添加量50、100、200 mg/kg处理组在培养的前15 d 随着培养时间的延长土壤中有效态Ni含量呈现增加的趋势；随后土壤中有效态Ni含量明显降低，至30 d时达到较低水平；在45 d时土壤中有效态Ni含量略微增加或稳定不变；随后，土壤中有效态Ni浓度明显下降，在培养60 d时达到最低水平；当土壤中Ni的添加量在≤25 mg/kg时，土壤中有效态Ni的含量没有呈现明显的规律性。

值得注意的是，除添加Ni浓度≤25 mg/kg的土样外，其余处理各培养时间土壤中有效态Ni含量添加降解菌的均高于相应不加降解菌。

看来微生物对土壤中Cd和Ni形态的影响机理不同，相关影响机理有待进一步研究。

2.2 土壤中重金属形态分布变化
图1描述了加菌与不加菌培养60 d后重金属Cd形态的变化。

经过60 d培养试验后，不同处理土壤中Cd形态分布发生了明显的变化。

但添加菌与不添加菌处理对土壤中Cd形态分布的影响没有明显差异。

不论添加菌与否，土壤中Cd 的可氧化态含量均下降，可还原态含量均略有增加。

当土壤中Cd的添加量低于5.0 mg/kg时，与未培养土壤相比，无论添加菌与否，培养60 d土壤Cd的弱酸提取态含量普遍呈下降趋势，残渣态含量均呈上升趋势；当土壤中Cd的添加量为5.0 mg/kg时，与未培养土壤相比，无论加菌与否，培养60 d土壤Cd的弱酸提取态含量和残渣态含量均增加；当土壤中Cd的添加量高于10.0 mg/kg时，与未培养土壤相比，无论添加菌与否，培养60 d土壤Cd的弱酸提取态含量均增加，残渣态含量普遍下降。

土壤重金属形态与重金属在土壤中的迁移性、可给性、活性及污染土壤修复有密切关系。

弱酸提取态重金属与土壤结合较弱，最易被释放，有较大的可移动性[19]；Fe/Mn氧化物结合态即可还原态在还原条件下易溶解释放[20]；有机物及硫化物结合态即可氧化态在氧化环境下易溶解释放；残渣态属于不溶态重金属，它只有通过化学反应转化成可溶态物质才对生物产生影响[19]。

因此，应该尤其重视高浓度Cd和石油复合污染土壤的研究，防止因Cd 的活化而造成的二次污染问题。

不论添加菌与否，培养60 d后土壤中Ni形态分布均发生了显著变化（图2）。

土壤中Ni可氧化态含量均下降，各处理组中其余形态分布并未呈现明显的规律性。

与Cd不同的是，添加降解菌对土壤Ni形态分布产生了显著影响。

添加降解菌的土壤中Ni的弱酸提取态含量均减少，且低于相应不添加菌的处理；残渣态含量均升高，且普遍高于相应不加菌的处理（未添加Ni处理除外）。

降解菌的添加对土壤Ni可还原态和可氧化态含量的影响没有明显的规律性。

值得注意的是，石油-重金属复合污染土壤微生物修复过程中，Ni的弱酸提取态、可还原态、可氧化态3种形态总量呈下降趋势，Ni的形态分布由不稳定向稳定方向迁移，降低了重金属Ni的活性。

这与DTPA提取态Ni 含量在培养60 d时达到最低水平是相符的。

3 结论
1）在石油-重金属复合污染土壤微生物修复过程中，土壤中有效态Cd和Ni 含量均随培养时间呈跌宕起伏变化，但土壤中有效态Cd与Ni的变化规律存在明显不同。

另外，除个别土样外，绝大多数添加降解菌的处理各培养时间土壤中有效态Cd含量均低于相应不加降解菌的处理；Ni的变化正好与此相反。

2）在微生物修复石油-重金属复合污染土壤过程中，重金属Cd、Ni的存在形态均发生了显著变化。

但加菌与不加菌处理对土壤中Cd形态分布的影响没有明显差异，说明土著微生物与外源降解菌对Cd形态分布影响机理相差不大。

在添加外源Ni的处理中，添加降解菌的土壤中Ni的弱酸提取态含量均减少，且低于相应不加菌的处理；残渣态含量均升高，且普遍高于相应不加菌的处理。

降解菌的添加对土壤Ni可还原态和可氧化态含量的影响没有明显的规律性。

参考文献：
[1] 戴树桂.环境化学进展[M].北京：化学工业出版社，2005.
[2] 沈国清，陆贻通，周培.土壤中重金属和多环芳烃复合污染研究进展[J].上海交通大学学报（农业科学版），2005，23（l）：102-106.
[3] 周东美.土壤中有机污染物-重金属复合污染的交互作用[J].土壤与环境，2000，9（2）：143-145.
[4] NDUKA J K C，CONSTANCE E. Selective bioaccumulation of metals by different parts of some fish species from crude oil water[J]. Bul Environ Contam Toxicol，2006，77（6）：846-853.
[5] NWADINIGWE C A，NWORGU O N. Metal contaminants in some Nigerian well-head crudes：Comparative analysis[J].J Chem Soc Nigeria，1999（24）：118-121.
[6] OSUJI L C，ONOJAKE C M. Trace heavy metals associated with crude oil：
A case study of Ebocha-8 oil-spill-polluted site in Niger Delta，Nigeria[J]. Chem Biodivers，2004，1（11）：1708-1715.
[7] CHUKWUJINDU L M A. Assesment of heavy metal speciation in soils impacted with crude oil in the Niger Delta，Nigeria[J].Chemical Speciation and Bioavailiability，2011，23（1）：7-15.
[8] 邵涛，刘真，黄开明，等.油污染土壤重金属赋存形态和生物有效性研究[J].中国环境科学，2000，20（1）：57-60.
[9] 马放，冯玉杰，任南琪.环境生物技术[M].北京：化学工业出版社，2003.
[10] 刘五星，骆永明，滕应，等.石油污染土壤的生物修复研究进展[J].土壤，2006，38（5）：634-639.
[11] 姚德明，许华夏，张海荣，等.石油污染土壤生物修复过程中微生物生态研究[J]. 生态学杂志，2002，21（1）：26-28.
[12] 李春荣，王文科，曹玉清，等.石油污染物的微生物降解研究[J]. 生态环境，2008，17（1）：113-116.
[13] 鲁如坤.土壤农业化学分析方法[M].北京：中国农业科学技术出版社，1999.
[14] DIBBLE J T. Effect of environmental parameters on the biodegradation of oil sludge[J]. Appl Environ Microbial，1979，37（4）：729-739.
[15] 史瑞和.土壤农化分析[M].北京：中国农业出版社，1996.
[16] 刘恩峰，沈吉，朱育新，等.重金属元素BCR提取法及在太湖沉积物研究中的应用[J].环境科学研究，2005，18（2）：57-60..
[17] 齐永强，王红旗，刘敬奇.土壤中石油污染物微生物降解及其降解去向[J].中国工程科学，2008，5（8）：70-75.
[18] 齐永强，王红旗，刘敬奇.土壤中石油污染物微生物降解过程中各石油烃组分的演变规律[J].环境科学学报，2003，23（6）：834-836.
[19] 吴新民，潘根兴.影响城市土壤重金属污染因子的关联度分析[J].土壤学报，2003，40（6）：921-929.
[20] 杨元根，PATERSON E，CANPBELL C.城市土壤中重金属元素的积累及其微生物效应[J].环境科学，2001，22（3）：44-48.。