串联质谱检测干血滤纸片氨基酸方法的建立
合集下载
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
二 、方法 1. 样品处理 参考 Zytkovicz等 [ 3 ] 报道的方 法 ,将 3 mm 干血滤纸片 (相当于 3. 2μl全血 ) ,置 于 96孔过滤板中 ,每孔加入 100 μl含内标甲醇 , 室温放置 20 m in,然后将萃取液离心至 96孔聚丙 烯板 , 55 ℃加热吹干 ,再加入 60 μl盐酸正丁醇 (3 mol/L ) , Teflon 膜覆盖 , 置 65 ℃恒温箱内 15 m in,随后 55 ℃加热吹干 ,再加入 100 μl 80%乙 腈 ,铝膜覆盖 ,即可上样检测 。 2. 仪器设置 流动相采用 80%乙腈 ,四元泵 流速设置变速 : 140 μl/m in, 0. 2 m in→30 μl/m in, 1. 0 m in→300μl/m in, 0. 2 m in。自动进样器设置 为每次取样 20 μl。质谱仪采用 2种扫描方法进 行检测 ,中性丢失扫描方式 (中性丢失片段 m / z 为 102)和多反应检测 。中性丢失扫描范围为 m / z 140～m / z 280,所检测的丁酯化后的氨基酸及 其对应的同位素内标质荷比分别为 A la: m / z 146.
238. 1, C62Tyr: m / z 244. 1; A sp: m / z 246. 2, D32 A sp: m / z 249. 2。多反应检测用于 Gly、O rn、A rg、 C it及其内标 , Q1 /Q3 扫描的质荷比分别为 : Gly:
m / z 132. 1 /m / z 76. 1; N l, Cl2Gly: m / z 134. 1 /m / z
·221·
2. 试剂 甲醇 ,正丁醇 ,乙酰氯 ,乙腈 ,高纯氮 气 ,盐酸正丁醇 ( 3 mol/L ) ,纯度均为高效液相色 谱级 。
3. 同位素内标及浓度 氨基酸内标共 12种 , 均购自美国 Cam bridge Iso tope Labs。分别为 15 N , 2213 C2甘氨酸 (N1, C12Gly) 、2 H4 2丙氨酸 (D42A la) 、 2 H8 2缬氨酸 (D82V al) 、2 H3 2亮氨酸 (D32Leu) 、2 H3 2 蛋氨酸 (D32M et) 、2 H5 2苯丙氨酸 (D52Phe) 、13 C6 2 酪氨酸 (C62Tyr) 、2 H3 2天冬氨酸 (D32A sp ) 、2 H3 2谷 氨酸 (D32Glu) 、2 H2 2鸟氨酸 (D22O rn) 、2 H2 2瓜氨酸 (D22Cit) 、2 H4 , 13 C2精氨酸 (D4, C l - A rg) 。所有 内标均用甲醇稀释为工作液 ,工作液浓度 N l, Cl2 Gly为 12. 5μmol/L ,其余均为 2. 5μmol/L。
·220·
检验医学 2005年第 20卷第 3期 Laboratory Medicine 2005, Vol 20. No 3.
文章编号 : 100122087 (2005) 0320220204 中图分类号 : R446. 1 文献标识码 : A
串联质谱检测干血滤纸片氨基酸方法的建立
韩连书 , 高晓岚 , 叶 军 , 邱文娟 , 顾学范 (上海第二医科大学附属新华医院 ,上海市儿科医学研究所 ,
1, D42A la: m / z 150. 1; Val: m / z 174. 2, D82Val:
m / z 182. 2; M et: m / z 206. 1, D32M et: m / z 209. 1;
Phe: m / z 222. 2, D52Phe: m / z 227. 2; Tyr: m / z
3. 自动定量分析 根据质谱峰的 m / z进行 定性 ,由于质谱峰强度与其代表的化合物含量呈 正比 ,通过测定离子峰的强度 ,可进行定量分析 。 定量分析是由计算机软件 (Chem V iew b5,美国生 物应用系统公司 )根据各种丁酯化的氨基酸及其 同位素内标的离子峰强度 ,由已知浓度的内标 ,自 动计算出所测样品中氨基酸浓度 。如 Phe (m / z 222. 2 ) 的量由它的内标 D52Phe (m / z 227. 2, 浓 度为 2. 5μmol/L )来定 。
78. 1; O rn百度文库 m / z 189. 2 /m / z 70. 2; D22O rn: m / z
191. 2 /m / z 72. 2; A rg: m / z 231. 2 /m / z 70. 2; D4, Cl2A rg: m / z 236. 2 /m / z 75. 1; C it: m / z 232. 1 /m / z 113. 1; D22C it: m / z 234. 2 /m / z 115. 2。每次总扫 描时间设置为 1. 4 m in,测试每个样品需 2. 5 m in。
关键词 :氨基酸 ; 串联质谱 ; 干血滤纸片
Ana lysis of am ino ac id in dry blood f ilter paper w ith tandem ma ss spectrom etry HAN L ianshu, GAO X iao2 lan, YE J un, Q IU W en juan, GU X uefan. D epa rtm en t of Ped ia tric Endocrinology and GeneticM etabolism , S hangha i Insti2 tu te for Ped ia tric R esea rch, X inhua Hospita l, S hangha i S econd M ed ica l U n iversity, S hangha i 200092, Ch ina Abstract: O bjective To establish a method for am ino acid analysis in dry blood filter paper by tandem mass spec2 trometry for newborn screening and diagnosis of am ino acid disorders in children. M ethods D ry blood spots of 3 mm diameter w ith different concentration of Phe, Tyr, Leu, M et, Val, Cit and stable isotope labeled internal standards were punched and extracted in methanol solution then derivatized w ith butanolic2HCl. After ward, the samp les were analysed by tandem mass spectrometry (AP I 2000). Precision ( coefficient of variation, CV ) , recovery, and linearity were ana2 lyzed. Results The intraassay CV and interassay CV were 6. 3% - 9. 7% and 9. 9% - 14. 3%. The recoveries of low level, m iddling level and high level of am ino acids were 92% - 100% , 94% - 104% and 98% - 107% respectively. The linearities of different concentration of am ino acids were 0. 999 0 - 0. 999 9. Conclusion s The p recision, recover2 y, and linearity of the tandem mass spectrometry method are high enough for am ino acids analysis, and it could be ap2 p lied on newborn screening and diagnosis for high risk children w ith inborn error of metabolism. Key words: Am ino acid; Tandem mass spectrometry; B lood filter paper
基金项目 :上海市科委科研基金资助项目 (024119021) 作者简介 :韩连书 ,男 , 1965年生 ,硕士 ,副教授 ,主要从事小儿内分泌 、遗传代谢病的临床诊治和研究工作 。 通讯作者 :顾学范 ; E2mail: guxuefan@ citizi. net。
检验医学 2005年第 20卷第 3期 Laboratory Medicine 2005, Vol 20. No 3.
许多遗传代谢病与氨基酸代谢异常有关 ,且 常常与多种氨基酸有关 。因此 ,临床上很需要一 种能够同时检测血多种氨基酸及其中间代谢产物 的方法 ,以便应用于疾病的诊断和治疗 。近几年 开展的液相串联质谱联用技术 (LC2M S /M S) ,能 够同时对一个样品中所含的数十种物质进行定性 和定量分析 。国外已有报道采用 LC2MS /M S检测 血氨基酸浓度 ,进行遗传代谢病筛查及诊断 [ 1, 2 ] 。 但目前 ,国内尚未见报道 ,我们在国内率先采用
LC2M S /M S,检测干血滤纸片中氨基酸 ,判断该技 术的精确性 、准确性和样品回收率 ,以便进一步应 用于遗传代谢病的筛查和相关疾病的诊断 。
材料和方法
一 、材料 1. 干血滤纸片 滤纸片型号为 S&S 903 #,抽 静脉血滴于滤纸片上 ,直径约 10 mm ,室温下凉 干 , - 20 ℃冰箱保存待测 。
小儿内分泌 、遗传代谢病研究室 ,上海 200092)
摘要 :目的 建立可靠的串联质谱技术检测干血滤纸片中氨基酸方法 ,以便用于氨基酸代谢紊乱疾病的筛 查和诊断 。方法 取含不同浓度氨基酸 (苯丙氨酸 、酪氨酸 、亮氨酸 、蛋氨酸 、瓜氨酸和缬氨酸 )的血滤纸片 ,用含 已知量相应氨基酸内标的甲醇萃取 ,盐酸正丁醇衍生后 ,用串联质谱仪检测血片中氨基酸谱及其浓度 。分析该 方法的精确性 、样品回收率及浓度相关性 。结果 氨基酸批内和批间变异系数分别为 6. 3% ～9. 7%、9. 9% ～ 14. 3%。低浓度回收率为 92% ～100% ,中等浓度回收率为 94% ～104% ,高浓度回收率为 98% ～107%。不同 浓度的氨基酸实测浓度与加入浓度之间的相关系数为 0. 999 0～0. 999 9。结论 串联质谱技术检测干血滤纸片 中氨基酸能够达到较高的精确性 、准确性和回收率 ,为临床进行氨基酸分析提供了一项新技术 ,可用于新生儿遗 传代谢病筛查 、高危儿童遗传代谢病的诊断及其他与氨基酸代谢有关的疾病诊治 。
4. 仪器 串联质谱仪 (M S /M S, AP I 2000,美 国生 物 应 用 系 统 公 司 ) , 高 效 液 相 仪 ( Agilent 1000,美国安捷仑公司 ) , 96 孔聚丙烯板 (滤膜孔 径 0. 2μm , M illipore公司 ) , 96 孔板吹干仪 (D ri2 B lock DB 230, Techne公司 ) 。
4. 方法精密度测定 用变异系数 ( CV )表示 精确性 ,采用同一个健康人干血滤纸片 ,在 1 d内 1次测定 10 份血片 ,计算这 10 份血片中氨基酸 的 CV 作为批内变异 ;每天 1次测定 10份血片 ,连 续 10 d,计算 10 d的氨基酸 CV 作为批间变异 。
238. 1, C62Tyr: m / z 244. 1; A sp: m / z 246. 2, D32 A sp: m / z 249. 2。多反应检测用于 Gly、O rn、A rg、 C it及其内标 , Q1 /Q3 扫描的质荷比分别为 : Gly:
m / z 132. 1 /m / z 76. 1; N l, Cl2Gly: m / z 134. 1 /m / z
·221·
2. 试剂 甲醇 ,正丁醇 ,乙酰氯 ,乙腈 ,高纯氮 气 ,盐酸正丁醇 ( 3 mol/L ) ,纯度均为高效液相色 谱级 。
3. 同位素内标及浓度 氨基酸内标共 12种 , 均购自美国 Cam bridge Iso tope Labs。分别为 15 N , 2213 C2甘氨酸 (N1, C12Gly) 、2 H4 2丙氨酸 (D42A la) 、 2 H8 2缬氨酸 (D82V al) 、2 H3 2亮氨酸 (D32Leu) 、2 H3 2 蛋氨酸 (D32M et) 、2 H5 2苯丙氨酸 (D52Phe) 、13 C6 2 酪氨酸 (C62Tyr) 、2 H3 2天冬氨酸 (D32A sp ) 、2 H3 2谷 氨酸 (D32Glu) 、2 H2 2鸟氨酸 (D22O rn) 、2 H2 2瓜氨酸 (D22Cit) 、2 H4 , 13 C2精氨酸 (D4, C l - A rg) 。所有 内标均用甲醇稀释为工作液 ,工作液浓度 N l, Cl2 Gly为 12. 5μmol/L ,其余均为 2. 5μmol/L。
·220·
检验医学 2005年第 20卷第 3期 Laboratory Medicine 2005, Vol 20. No 3.
文章编号 : 100122087 (2005) 0320220204 中图分类号 : R446. 1 文献标识码 : A
串联质谱检测干血滤纸片氨基酸方法的建立
韩连书 , 高晓岚 , 叶 军 , 邱文娟 , 顾学范 (上海第二医科大学附属新华医院 ,上海市儿科医学研究所 ,
1, D42A la: m / z 150. 1; Val: m / z 174. 2, D82Val:
m / z 182. 2; M et: m / z 206. 1, D32M et: m / z 209. 1;
Phe: m / z 222. 2, D52Phe: m / z 227. 2; Tyr: m / z
3. 自动定量分析 根据质谱峰的 m / z进行 定性 ,由于质谱峰强度与其代表的化合物含量呈 正比 ,通过测定离子峰的强度 ,可进行定量分析 。 定量分析是由计算机软件 (Chem V iew b5,美国生 物应用系统公司 )根据各种丁酯化的氨基酸及其 同位素内标的离子峰强度 ,由已知浓度的内标 ,自 动计算出所测样品中氨基酸浓度 。如 Phe (m / z 222. 2 ) 的量由它的内标 D52Phe (m / z 227. 2, 浓 度为 2. 5μmol/L )来定 。
78. 1; O rn百度文库 m / z 189. 2 /m / z 70. 2; D22O rn: m / z
191. 2 /m / z 72. 2; A rg: m / z 231. 2 /m / z 70. 2; D4, Cl2A rg: m / z 236. 2 /m / z 75. 1; C it: m / z 232. 1 /m / z 113. 1; D22C it: m / z 234. 2 /m / z 115. 2。每次总扫 描时间设置为 1. 4 m in,测试每个样品需 2. 5 m in。
关键词 :氨基酸 ; 串联质谱 ; 干血滤纸片
Ana lysis of am ino ac id in dry blood f ilter paper w ith tandem ma ss spectrom etry HAN L ianshu, GAO X iao2 lan, YE J un, Q IU W en juan, GU X uefan. D epa rtm en t of Ped ia tric Endocrinology and GeneticM etabolism , S hangha i Insti2 tu te for Ped ia tric R esea rch, X inhua Hospita l, S hangha i S econd M ed ica l U n iversity, S hangha i 200092, Ch ina Abstract: O bjective To establish a method for am ino acid analysis in dry blood filter paper by tandem mass spec2 trometry for newborn screening and diagnosis of am ino acid disorders in children. M ethods D ry blood spots of 3 mm diameter w ith different concentration of Phe, Tyr, Leu, M et, Val, Cit and stable isotope labeled internal standards were punched and extracted in methanol solution then derivatized w ith butanolic2HCl. After ward, the samp les were analysed by tandem mass spectrometry (AP I 2000). Precision ( coefficient of variation, CV ) , recovery, and linearity were ana2 lyzed. Results The intraassay CV and interassay CV were 6. 3% - 9. 7% and 9. 9% - 14. 3%. The recoveries of low level, m iddling level and high level of am ino acids were 92% - 100% , 94% - 104% and 98% - 107% respectively. The linearities of different concentration of am ino acids were 0. 999 0 - 0. 999 9. Conclusion s The p recision, recover2 y, and linearity of the tandem mass spectrometry method are high enough for am ino acids analysis, and it could be ap2 p lied on newborn screening and diagnosis for high risk children w ith inborn error of metabolism. Key words: Am ino acid; Tandem mass spectrometry; B lood filter paper
基金项目 :上海市科委科研基金资助项目 (024119021) 作者简介 :韩连书 ,男 , 1965年生 ,硕士 ,副教授 ,主要从事小儿内分泌 、遗传代谢病的临床诊治和研究工作 。 通讯作者 :顾学范 ; E2mail: guxuefan@ citizi. net。
检验医学 2005年第 20卷第 3期 Laboratory Medicine 2005, Vol 20. No 3.
许多遗传代谢病与氨基酸代谢异常有关 ,且 常常与多种氨基酸有关 。因此 ,临床上很需要一 种能够同时检测血多种氨基酸及其中间代谢产物 的方法 ,以便应用于疾病的诊断和治疗 。近几年 开展的液相串联质谱联用技术 (LC2M S /M S) ,能 够同时对一个样品中所含的数十种物质进行定性 和定量分析 。国外已有报道采用 LC2MS /M S检测 血氨基酸浓度 ,进行遗传代谢病筛查及诊断 [ 1, 2 ] 。 但目前 ,国内尚未见报道 ,我们在国内率先采用
LC2M S /M S,检测干血滤纸片中氨基酸 ,判断该技 术的精确性 、准确性和样品回收率 ,以便进一步应 用于遗传代谢病的筛查和相关疾病的诊断 。
材料和方法
一 、材料 1. 干血滤纸片 滤纸片型号为 S&S 903 #,抽 静脉血滴于滤纸片上 ,直径约 10 mm ,室温下凉 干 , - 20 ℃冰箱保存待测 。
小儿内分泌 、遗传代谢病研究室 ,上海 200092)
摘要 :目的 建立可靠的串联质谱技术检测干血滤纸片中氨基酸方法 ,以便用于氨基酸代谢紊乱疾病的筛 查和诊断 。方法 取含不同浓度氨基酸 (苯丙氨酸 、酪氨酸 、亮氨酸 、蛋氨酸 、瓜氨酸和缬氨酸 )的血滤纸片 ,用含 已知量相应氨基酸内标的甲醇萃取 ,盐酸正丁醇衍生后 ,用串联质谱仪检测血片中氨基酸谱及其浓度 。分析该 方法的精确性 、样品回收率及浓度相关性 。结果 氨基酸批内和批间变异系数分别为 6. 3% ～9. 7%、9. 9% ～ 14. 3%。低浓度回收率为 92% ～100% ,中等浓度回收率为 94% ～104% ,高浓度回收率为 98% ～107%。不同 浓度的氨基酸实测浓度与加入浓度之间的相关系数为 0. 999 0～0. 999 9。结论 串联质谱技术检测干血滤纸片 中氨基酸能够达到较高的精确性 、准确性和回收率 ,为临床进行氨基酸分析提供了一项新技术 ,可用于新生儿遗 传代谢病筛查 、高危儿童遗传代谢病的诊断及其他与氨基酸代谢有关的疾病诊治 。
4. 仪器 串联质谱仪 (M S /M S, AP I 2000,美 国生 物 应 用 系 统 公 司 ) , 高 效 液 相 仪 ( Agilent 1000,美国安捷仑公司 ) , 96 孔聚丙烯板 (滤膜孔 径 0. 2μm , M illipore公司 ) , 96 孔板吹干仪 (D ri2 B lock DB 230, Techne公司 ) 。
4. 方法精密度测定 用变异系数 ( CV )表示 精确性 ,采用同一个健康人干血滤纸片 ,在 1 d内 1次测定 10 份血片 ,计算这 10 份血片中氨基酸 的 CV 作为批内变异 ;每天 1次测定 10份血片 ,连 续 10 d,计算 10 d的氨基酸 CV 作为批间变异 。