荧光探针

染料和荧光蛋白的选择
• 荧光标记：可被基因编码，使活细胞蛋白 容易被荧光蛋白标记。
• 染料：对很多分子通用，例如蛋白，核酸， 低聚糖等。常用免疫荧光法，标记内源性 表达蛋白，但阻止大多活细胞成像。
免疫荧光技术
• 免疫荧光细胞化学是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗 体标记上荧光素制成荧光标记物，再用这种荧光抗体（或抗原）作为 分子探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。
网格蛋白小窝的3D图像
传统图像
3D图像百度文库
XY投影面 XY横切面 XZ横切面
网格蛋白绿发动蛋白（免 疫荧光）蓝绿混合3D图
干涉法
• 在3D STORM/PALM中最高纵向分辨率用两 个对立目标在4Pi和I5M显微镜下通过干涉法 完成。
图像2C:明显显示了线粒体的内膜和外膜在突 出部位的分离 和PSF方法比，图像深度较小，可通过对样品 反复扫描改善。实际中，图像深度受球面相 差影响，例如厚样品的高荧光背景。
• 这个方法中要研究的蛋白和一个标记的蛋白融合，反过来 阻止荧光染料和特定反应基的亲和力。
3D成像
• 应用了简单的光学设计，利用了光的像散 性使光波在垂直方向上有不同焦点。
• 特别的，把柱面透镜插在成像通路上，单 个分子的形状变为椭圆形，可决定分子的 轴向和横向。(图像3B)
光的像散
• 轴外物点用光束成像时形成两条相互垂直 且相隔一定距离的短线像的一种非对称性 相差）
活细胞成像
• STED:受激发射损耗（STED）显微术利用荧光饱和与激发态荧光受激 损耗的非线性关系,并通过限制受激辐射衰减的区域,减少荧光光斑大 小,获得小于衍射极限的发光点来提高系统分辨率,从而突破远场光学 显微术的衍射极限分辨力限制来实现无接触三维成像。
• SIM:3D-SIM照明技术可实现对样品的光学切片，可在20μm的厚度内以 更高的分辨率呈现细胞结构的更多细节。
• 结构中运动的分子的动作可从这些单一分子踪迹在毫秒时间分辨率中 获得，这种成像方式极大扩充了单个分子的动态成像
荧光探针
STORM/PALM对荧光探针的限制
• 在一定波长内有荧光状态发光，一定波长内不发光 • 高精度定位要求变暗前探针要发出大量光量子 • 只有一个荧光团能在受衍射限制的区域被激活，剩余大量
荧光团处在黑暗状态，要使这些荧光团光的发射最小化， 确保被激活分子的高精度定位 • 所有可切换的荧光团可自发被热能或成像激光激活，阻止 了单一分子的检测，所以要求低自发激活率
• 在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有荧光素，利用荧光显微 镜观察标本，荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光（黄绿色或桔 红色），可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性 质、定位，以及利用定量技术测定含量。
• 染料有一个更高的光量子输出，有更高的图像分辨率。 （图像3D）但使用免疫荧光法时，在极高的分辨率下体积 庞大的抗体蛋白限制图像分辨率，所以开发了一项新的融 合系统，结合两种方法的优点。
• 所以更亮更快切换的有机染料会提高成像速度。
• Photoactivation(光敏化?)和单个分子的结合可以追踪活细胞可视动态 结构。
• 和传统不同，光控开关探针允许高密度的目标分子被标记和追踪。
• 光控开关荧光蛋白可由激光控制，光控开关荧光蛋白的优势在于：可 以对所有的分子进行标记，在显微镜下用一种激光对一种分子进行单 独操作，随意控制该分子的发光状态和发光时间。
• 用STED和SIM成像时要权衡立体分辨率和时间分辨率。指定立体分辨 率时要考虑NYGUIST,这会限制时间分辨率。
• 用Eos荧光蛋白标记黏着斑复合体时每个框架时间分辨率为25-60秒， NYGUIST空间分辨率为60-70nm，还有类似例子（略）
• 缓慢的成像速度是要求的，一方面因为荧光蛋白缓慢的猝灭，一方面 是在高激发强度下质子输出的减少。