青蒿素代谢工程研究

代谢工程

Metabolic engineering

建立在重组DNA技术基础之上的代谢工程技术，是一种在理解细胞代谢功能的基础上，有目的地设计和改造生物体中已有的代谢网络和表达调控网络，从而实现更高效的生物化学转化、能量转移及大分子装配过程的技术。代谢工程技术能够有效地克服传统育种手段的突变非定向性和设计非理性的缺点，自诞生以来，在改造植物、动物、微生物的代谢功能方面得到了广泛的应用。

青蒿素是一种由我国学者在20世纪70年代初从Artemisiaannua L（菊科植物，俗称青蒿）中提炼出来的倍半萜内环酯环内过氧化物（C-15倍半萜），通过释放高济量的自由基杀死隐藏于红细胞中的恶性疟原虫，是面前世界上最有效的治疗脑型疟疾和抗氯喹恶性疟疾的药物，被世界卫生组织称为治疗疟疾的最大希望。

人工合成青蒿素由于其工艺复杂、毒副作用大、成本高而不能投入生产。世界上青蒿素药物的生产主要依靠我国从野生和在栽培青蒿中直接提取。但是青蒿素的含量很低（0.1%—1%w/w)，且受地域性种植影响较大。目前使用青蒿素进行治疗每个疗程懂得费用是8美元到15美元，对于受疟疾危害最深的非洲和南美地区的贫困患者来说过于昂贵。

酵母的生长代谢速率较青蒿要高出很多倍，而且其培养条件容易控制，不受气候、政治等因素的影响。因此，如果能用酵母生产青蒿酸，那将是非常高产、高效的。基于这些因素，科学家们开始尝试利用代谢工程手段通过微生物去合成这种物质。这项工作被专门列为“青蒿素计划”。由美国加利福尼亚大学伯克利

分校的升化工程师Jay

Keasling支持，并且起

初就获得“比尔-梅琳达

盖茨基金会”4260万美

元的资助。

由于酵母也可以

合成FPP，所以我们所

需要做的只是将FPP

到青蒿酸前体

（amorphadiene)、青蒿

酸前体到青蒿酸这两个过程克隆进入酵母细胞内，并对细胞内的其他与之相关的基因进行调控，使之能正常并且大量合成青蒿酸。

第一步，为了能让

酵母细胞合成青蒿酸前

体，我们将ADS基因插

入由GAL1启动子控制

转录的pRS 425质粒

中，然后在酵母细胞中

表达，结果显示单独转

入ADS基因的酵母只

合成少量的青蒿酸前

体。如图中菌株

EPY201，4.4mg/L。

而细胞中与青蒿酸前体的量最直接相关的就是ＦＰＰ的量，所以，为了提高啤酒酵母合成青蒿酸前体的能力，我们对FPP合成途径（甲羟戊酸合成途径）进行了总共5次的基因工程改造。

几个与FPP合成相关的基因的表达被正调控，而另外几个促使FPP转变成固醇的基因被负调控。同时为了保证宿主菌株的遗传稳定性，所有这些对宿主细胞进行的修饰都是通过软色体融合进行的。具体过程如下：

①将一种截断的水溶性酶3-羟基-3-甲基-戊二酰辅酶A还原酶（简称HMGCo 还原酶，又简称tHMGR，是固醇合成的限速每）过表达，可提高青蒿酸前体的

合成产量近五倍（菌株EPY208）；

②利用一个methioninerepressible启动子（PMET3），通过对编码鲨稀合酶（固醇生物合成途径中FPP合成后的第一步）的ERG9基因进行负调控，可将amorhpadiene的合成量再增加两倍（菌株EPY225）；

③然后，尽管ｕｐｃ２－１，一个可以加强ＵＰＣ２（啤酒酵母中调节固醇合成的一个的通用转录因子）活性的半显性突变体等位基因，在已有菌株EPR ２０８背景下过表达（菌株ＥＰＲ２０８）度青蒿酸前体合成的提高的作用并不显著，但结合对ＥＲＧ９基因的负调控，其该表达可将青蒿酸前体的合成量提高到１０５ｍｇ／Ｌ（菌株ＥＰＲ２１３）；

④再次，在酵母软色体更远处在转进一个ｔＨＭＧＲ拷贝可以将其合成量再增加５０％达到１４９ｍｇ／Ｌ（菌株EPY２１９）；

⑤最后，虽然编码FPP合酶的基因（ERG20）过表达对青蒿酸前体合成总量（菌株EPY224）的提高效果非常小，但在细胞密度降低的情况下其合成量却可增加10%。将所以这些对基因的修饰综合在菌株EPY224上，青蒿酸前体的合成量已经达到了153mg/L，是之前所报道这种倍半萜（烯）最大合成水平的几乎500倍。

现在我们已经得到了可以高效合成青蒿酸前体的酵母菌株，但为能将青蒿酸前体转变成青蒿酸，我们还需要找到并分离出青蒿中编码催化青蒿酸前体转变成青蒿酸的酶的基因。

据报道，知道一种特异的细胞色素P450酶对青蒿酸前体进行专一性羟化，并通过数据库检索得到细胞色素P450已表达序列标志（ESTs），而且已拥有针对CYP71和CYP82家族（P450酶在菊科植物中最多的两个家族，其序列已知）高度特异的简并引物。

接下来就是通过对以上条件的运用得到青蒿中这种特异的细胞色素P450基因。

经过以上不足，相应的完整

P450cDNA(CYP71A V1),一个编码495个氨基酸的

开放阅读框，成功从青蒿中分离获得。

为了保证异源表达的CYP71V A1可以发挥正

常功能，协同它进行氧化还原反应的天然配体，

NADPH：细胞色素P450氧化还原（CPR），同样

从青蒿中成功分离，并且其升华活性已经在体外

被证实。（左侧图）

经证明，体外实验中重组的CYP71A V能将

amorpha—4，11—diene高效转化为青蒿酸，完全显示出膜结合、多功能的CYP71A V1是青蒿素的生物合成中的关键促成因素。

提纯

通过用碱性缓冲液（PH为9

的Tris—HCL缓冲液中添加1.2M

的山梨醇）清洗细胞沉淀物，绝

大部分合成的青蒿酸（>90%)可

以而被分离出，而且冲洗之后小

标题和培养基中的残留量近卫

2%。青蒿酸不仅可以被高效的转

移到细胞外，且在酸性条件下经

过质子化后会被束缚在细胞表

面。利用这个特点制定了一种便

捷提纯方法（见右图）

经检测，可以确定所得到的

这株转基因酵母在发酵罐中能够直接合成结构功能上完全正确的青蒿酸且转基因酵母菌株大单位生产效率比青蒿高了近两个数量级。